黄连水提物对LPS诱导的猪肠道上皮细胞IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表达及NF-κB/MAPK 信号通路的调控作用

李春林,张 翥,曾荣荣,金美兰,张永宁,彭远义,王自力∗ (.西南大学 动物科技学院,重庆

北碚400715；2.中国检验检疫科学研究院 动物检疫研究所,北京100176)

仔猪大肠杆菌性腹泻病也称为仔猪黄痢、白痢,主要是由致病性大肠杆菌感染引起。致病性大肠杆菌是猪的一种重要的常见肠道病原菌,可引起仔猪的腹泻,伴随脱水、饲料转化率下降和生长性能受到抑制[1],给生猪健康养殖带来了巨大危害。研究表明,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是大肠杆菌等G－菌的细胞壁结构成分之一,是介导革兰阴性菌脓毒症的重要启动因子；可通过其结合受体或调节蛋白的作用,诱导宿主多种细胞因子的合成和释放,触发肠道及全身的微循环障碍,甚至发生弥漫性血管内凝血(DIC)；同时还可激活上皮细胞释放大量的细胞因子和炎性介质,加剧炎症反应和局部组织的炎性损伤[2-3]。LPS在机体内通过活化TLR4(Tolllike receptor 4),降解IκB(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase),来解除对NF-κB(nuclear factor-kappa B)的抑制,而后进入核内促进炎性细胞因子包括TNF-ɑ、IL-1β、IL-6的转录,进一步促进NFκB的活化,形成局部炎症扩大的级联效应。除此外,NF-κB 的活化还受到MAPK (mitogen-activated protein kinase)信号的调节[4]。

研究表明,黄连具有清热燥湿、泻火解毒的功效,常用于治疗泻痢、腹泻等胃肠道疾病[5],小檗碱是其主要有效成分之一,可有效治疗肠道炎症,抑制葡聚糖硫酸钠诱导的肠道上皮细胞完整性破坏,抑制LPS诱导的血液单核细胞和巨噬细胞趋化因子的表达,以及肠道炎性因子的分泌等功效[6-7]。为了阐释中药黄连防治猪大肠杆菌性肠道炎症的作用机制,试验通过利用LPS诱导猪肠道上皮细胞炎性反应模型,检测黄连水提物对LPS诱导猪肠道上皮细胞的炎性细胞因子、NF-κB/MAPKs信号通路关键蛋白表达变化,以探讨其抗炎作用机制。

1 材料与方法

1.1 猪肠道上皮细胞猪肠道上皮细胞IPEC-J2由西南大学生物饲料与分子营养实验室馈赠,液氮冻存,经10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12完全培养基于5%CO2,37℃条件下复苏,连续培养3代后用作试验。

1.2 药品与试剂黄连干燥品购于重庆市桐君阁大药房；分析纯盐酸小檗碱(17110105)购自成都曼思特生物科技有限公司；DMEM/F12 培养基(11330-057)、胎 牛 血 清(210270K)、胰 酶(25200-056),均购自GIBCO 公司；青链霉素(P1400)、全蛋白提取试剂盒(BC3710)购自北京Solarbio 公司；MTT(410C0516)购自Sigma 公司；RNAiso Plus(9109)、逆转录试剂盒(RR047A)购自Ta KaRa公司；Sso Advanced Universal SYBR© Green 超混合液(172-5271)购 自Bio-Rad 公 司；兔 抗 猪IκB(4814S)、p-IκB(2859)、p-p65(4025S)、p38(8690S)、p-p38(9215S)、JNK(9252S)、p-JNK(9251S),鼠抗猪p65(6956S)及二抗羊抗鼠Ig G-HRP(7076S)、羊抗兔IgG-HRP(7074S),均购自美国CST 公司；兔抗猪β-actin(ab3280),购自Abcam 公司；无水乙醇、异丙醇、三氯甲烷均为分析纯试剂。

1.3 仪器设备Thermo二氧化碳培养箱、超净工作台、OLYMPUS 倒置显微镜、BIO-RAD 酶标仪、日立高速低温离心机、BIO-RAD 荧光定量PCR 仪、Implen超微量分光光度计和凝胶成像系统。

1.4 黄连水提物制备方法取100 g黄连干燥品,分别按1∶10和1∶8比例加入蒸馏水煎煮2次,双层纱布过滤后取滤液,于旋转蒸发仪浓缩至生药1 g/m L；经滤纸过滤,3 000 r/min离心20 min后取上清,经Φ0.22μm 滤膜过滤,4℃保存备用。

1.5 黄连水提物中小檗碱含量测定取小檗碱标准品用超纯水溶解后,分别配制为25,250,500,1 000 mg/L,在200～800 nm 用超微量分光光度计检测不同质量浓度小檗碱的吸光度,确定最适吸光度,并用上述梯度浓度制作标准曲线,同时检测黄连水提物样品的吸光度,利用小檗碱标准曲线计算黄连水提物中小檗碱含量。

1.6 MTT法检测不同质量浓度LPS或黄连水提物对IPEC-J2细胞增殖的影响体外培养IPEC-J2细胞,按照5×104个/m L,100μL/孔接种于96孔板培养24 h。各孔细胞经1×PBS清洗3次后,分别向各孔内加入含终质量浓度为0.0,0.1,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0,20.0 mg/L 的LPS 或含终质量浓度为0.0,0.01,0.1,0.5,1.0,5.0,10.0,20.0 g/L生药的黄连水提物的无血清及双抗的DMEM 基础培养液,于37℃、5%CO2条件下培养24 h后,向各孔细胞加入5 g/L MTT液10μL,继续培养4 h后,吸弃培养基,加入100μL DMSO振荡10 min后在490 nm 处检测各孔吸光值(D值),分别计算各组细胞活力。细胞活力(%)＝(D药物组－D空白组)/(D对照组－D空白组)×100%。

1.7 Real-time PCR法检测炎性细胞因子mRNA表达体外培养猪肠道上皮细胞,按5×106个/m L 接种于6孔板,每孔2 m L,培养48 h至单层融合后分为对照组、LPS 组、黄连低剂量组(low)、黄连中剂量组(mid)、黄连高剂量组(hig),每组各3个重复。分别向黄连低、中、高剂量组细胞加入相应剂量的黄连水提物,对照组和LPS组分别加入相同体积的基础培养基于37℃、5%CO2条件下培养4 h；吸弃培养基,用37℃的PBS清洗后,分别向除对照组外各组细胞加入2 m L含5 mg/L LPS的基础培养基,继续培养1 h；吸弃培养液经1×PBS清洗3次后,Trizol法提取细胞总RNA,经反转录后获取cDNA；查阅GenBank,经Primer 5 软 件 设 计 猪β-actin、IL-1β、IL-6和TNF-ɑ引物(表1)。参照Bio-Rad荧光定量试剂盒说明,采用10μL 反应体系。95℃预变性3 min；95℃变性5 s,各退火温度30 s,40 个循环。每个样品3个重复,以相对表达量计算基因表达水平,采用2－△Ct法计算基因相对定量：相对表达量＝2－△△Ct,△△Ct＝试验组(Ct目的基因－Ct内参基因)－对照组(Ct目的基因－Ct内参基因)。

表1 目的基因扩增引物序列

1.8 Western blot法检测细胞NF-κB/MAPK 信号通路蛋白表达参照1.7培养和处理猪肠道上皮细胞后,吸弃各孔的细胞培养液,经1×PBS液清洗3次,RIPA 裂解法提取各孔细胞总蛋白,BCA 法测定蛋白浓度；蛋白样品经8%SDS-PAGE 100 V 电泳,100 V、80 min 转膜,5%脱脂奶粉封闭1 h,置于4℃、20 r/min水平摇床条件下加入一抗孵育过夜；室温下二抗孵育1 h,ECL 液显色后凝胶成像系统拍照,Image lab 5.0软件计算蛋白条带灰度值。

1.9 数据处理与分析数据以平均值±标准差表示,SPSS19.0 软件单因素方差分析(One-way ANOVA)统计各组间差异显著性,Graphpad prism 6.0 软件绘图。

2 结果

2.1 黄连水提物中小檗碱含量测定由图1可知,经Implen超微量分光光度计检测,小檗碱在226,265,345 nm 处都具吸光峰值,为避免杂质对低吸光值的影响,故选择以较高的345 nm 处的吸光度为测量值,计算后确定黄连水提物中小檗碱含量为70 g/L,总含量为7%,符合小檗碱含量不得低于5.5% 的药典要求[7],为合格中药。

2.2 不同质量浓度LPS及黄连水提物对IPEC-J2细胞活力的影响由图2 可知,经不同质量浓度LPS 刺 激IPEC-J2 细 胞 后,仅5.0 mg/L LPS 组IPEC-J2的细胞活力显著高于对照组(P＜0.05),其余各组均与对照组无显著性差异(P＞0.05)。由图3可知,0.1,0.5,1.0 g/L 的黄连水提物组的IPECJ2细胞活力均显著或极显著高于对照组(P＜0.05或0.01),且以0.5 g/L组最高；10.0,20.0 g/L 黄连水提物组的细胞活力均显著低于对照组(P＜0.01),5.0 g/L 组与对照组无显著性差异(P＞0.05)。故选择0.1,0.5,5.0 g/L作为黄连水提物的低(low)、中(mid)、高(hig)质量浓度组,进行后续研究。

图1 黄连水提物中小檗碱含量测定 A.小檗碱标准品在200～800 nm 的吸光值；B.小檗碱在345 nm 吸收值标准曲线(y＝0.001 5－0.018,R 2＝0.999 0)

图2 不同质量浓度LPS对猪肠道上皮细胞细胞活力的影响(n＝10) 注：与对照组相比,∗表示差异显著(P＜0.05),∗∗表示差异极显著(P＜0.01)。下同

图3 不同质量浓度黄连水提物对猪肠道上皮细胞细胞活力的影响(n＝10)

2.3 黄连水提物对LPS诱导的IPEC-J2细胞炎性细胞因子mRNA表达的影响由图4可知,与对照组相比,经LPS处理IPEC-J2细胞1 h后,炎性细胞IL-1β、IL-6、TNF-ɑm RNA 表达水平均极显著升高(P＜0.01),黄连低剂量组的IL-1β、TNF-ɑm RNA表达水平显著高于对照组(P＜0.05),IL-6表达水平极显著高于对照组(P＜0.01),黄连中剂量组的TNF-ɑ表达水平显著高于对照组(P＜0.05),其余组与对照组均无显著性差异(P＞0.05)。与模型组相比,黄连低剂量组的IL-1β、IL-6 和TNF-ɑ mRNA 表达水平均显著或极显著低于模型组(P＜0.05或0.01)。

2.4 黄连水提物对LPS诱导的IPEC-J2细胞NFkB/MAPK 信号通路的影响由图5可知,LPS作用于IPEC-J2细胞1 h后,IPEC-J2细胞的P65、p-P65及p-IκB 蛋白表达水平均极显著高于对照组(P＜0.01)；经过黄连水提物预处理的细胞IκB、p-IκB、P65及p-P65蛋白表达水平均呈下降趋势,且随着黄连水提物质量浓度的升高而下降；其中,以黄连水提物中、高剂量组的IκB、p-IκB、P65及p-P65蛋白表达水平均显著或极显著低于LPS组(P＜0.05或0.01)。

由图6可知,IPEC-J2细胞经LPS作用1 h后,p-JNK、p-p38蛋白表达水平均极显著高于对照组(P＜0.01)；经低、中、高剂量黄连水提物预处理后的IPEC-J2细胞的JNK、p-JNK 及p-p38蛋白表达水平均下降,同时中、高剂量组的JNK、p-JNK 和pp38蛋白表达水平均极显著低于LPS 组(P＜0.01),且显著或极显著低于对照组(P＞0.05 或0.01)。

图4 不同质量浓度黄连水提物对猪肠道上皮细胞炎性细胞因子mRNA 表达的影响(n＝5) 注：与对照组相比,∗表示差异显著(P＜0.05),∗∗表示差异极显著(P＜0.01)；与模型组相比,＃表示差异显著(P＜0.05),＃＃表示差异极显著(P＜0.01)。con.对照组；mod.LPS组(模型组)；low.低剂量组；mid.中剂量组；hig.高剂量组。下同

图5 黄连水提物对猪肠道上皮细胞NF-κB信号通路关键蛋白表达水平的影响(n＝3)

图6 黄连水提物对猪肠道上皮细胞MAPK 信号通路关键蛋白表达水平的影响(n＝3)

3 讨论

大肠杆菌是引起仔猪黄痢、白痢、水肿病的主要病原,其中LPS 是大肠杆菌细胞壁的主要成份之一,可引发猪肠道上皮细胞的强烈炎性反应,释放出大量促炎性细胞因子[8],造成严重的猪肠道炎症。中药黄连苦寒,具有清热燥湿、泻火解毒功效,可用于治疗肠胃湿热壅滞之证,如肠黄作泻、热痢后重等,并含有小檗碱及黄连碱、甲基黄连碱等多种生物碱,对大肠杆菌、葡萄球菌、流感病毒等具有抑制作用[5],中兽医常用于防治畜禽大肠杆菌性肠炎[9]。

3.1 LPS及黄连水提物对猪肠道上皮细胞细胞活力的影响MTT(四甲基偶氮唑盐)经线粒体琥珀酸脱氢酶裂解后产生蓝紫色产物(formazan),其生成量与细胞释放的酶活性成正比,而酶活力与细胞数及细胞活力成正比,常用于检测细胞增殖、分化及细胞代谢相关的免疫学试验研究中[10]。在本研究中用MTT 法检测猪肠道上皮细胞的细胞活力变化,表明5 mg/L LPS可显著提高猪肠道上皮细胞的细胞活力,且1,10 mg/L的LPS均可有效诱导猪肠道上皮细胞增殖及炎性细胞因子的分泌[11]。故本研究选择5 mg/L LPS作为细胞炎性反应的诱导质量浓度。同时,不同质量浓度的黄连水提物均可提高猪肠道上皮细胞的细胞活力,可有效促进猪肠道上皮细胞的增殖和生长,有助于肠道黏膜损伤的修复；因此,选择了0.1,0.5,1.0 g/L 作为黄连水提物的低、中、高质量浓度进行后续研究。

3.2 黄连水提物可调节LPS诱导的猪肠道上皮细胞炎性细胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α mRNA 表达

IL-1β、IL-6及TNF-α均为促炎性细胞因子,可诱导组织细胞严重的炎性免疫反应。其中IL-1具有促进细胞生长分化、凋亡及诱导炎性反应等作用；IL-6可诱导淋巴细胞分化和增殖,清除病原微生物；TNF-α可在感染部位通过促进血管内皮细胞的表达,刺激白细胞介素和趋化因子,诱导白细胞在炎症部位大量聚集,促使对炎症部位细菌体进行清除[12],是治疗炎性疾病的药物作用靶点[13]；因此,促炎性细胞因子在组织细胞的炎性反应中具有重要的免疫调节作用。

本研究表明,LPS 可诱导猪肠道上皮细胞IL-1β、IL-6 及TNF-α m RNA 表达水平升高,而LPS是大肠杆菌死亡后释放到肠道内的主要毒素之一,可首先作用于肠道上皮细胞,可引起猪肠道上皮细胞的炎性细胞因子表达水平升高,引起炎症反应,与文献报道结果一致[11]；而黄连水提物预处理后的猪肠道上皮细胞,经LPS持续作用后,其炎性细胞因子表达并未升高,且以高剂量组效果最好,这说明黄连水提物可有效阻止大肠杆菌内毒素诱导的肠道上皮细胞的炎症反应。研究表明,黄连水煎液可不同程度改善溃疡性结肠炎引起的大鼠体质量增加过慢,并能有效维护肠绒毛完整性和肠道上皮细胞结构正常性,达到治疗大鼠溃疡性结肠炎的作用[14-15]。因此,黄连水提物具有抑制LPS诱导的猪肠道上皮细胞炎性细胞因子表达,达到调节肠道炎症反应的作用,这有助于阐释黄连防治猪大肠杆菌病的作用机制。

3.3 黄连水提物对LPS 诱导的猪肠道上皮细胞NF-κB/MAPK 信号通路的调节作用NF-κB 是广泛存在于各种细胞中的一个转录因子家族,可调节细胞的免疫应答、炎症反应和细胞凋亡等相关基因的转录,可被多种刺激因子如LPS、TNF、IL-1β等激活,诱导促炎性细胞因子(IL-1、IL-6、TNF-α)的大量表达[16]。MAPK 是真核细胞中的信号转导模块,可介导胞外信号刺激传入胞内,调节细胞生长、分化、迁移和炎症等过程,可分为细胞外信号调节激酶(ERKs)、c-Jun 氨 基 末 端 激 酶(JNKs)和p38 MAPK 激酶,其中炎性细胞因子、生长因子及细胞应激均可激活该通路,调节下游炎性细胞因子的表达[17],两者在组织细胞的炎性免疫调控中具有重要作用。

本研究表明,黄连水提物可有效抑制LPS诱导的猪肠道上皮细胞NF-κB信号通路中IκB、p-IκB、P65及p-P65等关键通路蛋白的表达,并能抑制细胞的MAPK 信号通路中JNK、p-JNK 和p-p38蛋白的表达,且以中、高剂量组黄连水提物效果最好,即黄连水提物通过抑制NF-κB/MAPK 信号通路的关键通路蛋白的磷酸化和表达,进而抑制其下游促炎性因子的表达。黄连水提物主要含有小檗碱、黄连碱、药根碱、非洲防己碱、表小檗碱及巴马汀等,且以小檗碱含量最高[18]。小檗碱可通过抑制DSS诱导的炎性肠病(IBD)小鼠肠道组织中的NF-κB/MAPK 信号通路,抑制促炎性细胞因子的表达起到保护肠道组织的作用[19]；在相同给药剂量和含等剂量的盐酸小檗碱条件下,黄连总生物碱对小鼠结肠炎的治疗作用较盐酸小檗碱更好[20]；黄连水提物可抑制细胞凋亡,减少细胞TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症反应细胞因子的释放,抑制NF-κB p65 蛋白核转移,阻碍R4/NF-κB、TLR4/IRF3 等信号通路的传导,实现对LPS 诱导的肝细胞炎性损伤的保护作用[21]。因此,黄连水提物可有效抑制LPS对IPECJ2细胞NF-κB/MAPK 信号通路的激活作用,进而抑制下游炎性细胞因子的表达,实现对猪大肠杆菌性肠道炎症的防治作用；但尚需就黄连水提物中的不同生物碱的抗炎作用及机制进行深入研究,以便阐释中药黄连在治疗大肠杆菌性疾病中的作用机制。