脂联素受体激动剂(AdipoRon)对鸡成骨细胞增殖和凋亡的影响

江 莎,吴晓玲,程婷婷,张嘉容,魏学良 (.西南大学 动物科技学院,重庆 北碚40075；.南京农业大学 动物医学学院,江苏 南京0095；.南京医科大学 公共卫生学院,江苏 南京00)

2013年,OKADA-IWABU 等[1]筛选出了一些能够结合并激活脂联素受体的小分子化合物,并将其中一种命名为脂联素受体激动剂(AdipoR agonist,AdipoRon)。研究发现,Adipo Ron 可与AdipoR1和AdipoR2结合,激活AMPK 和PPAR-α信号通路,改善高脂饲料饲喂小鼠的胰岛素抵抗和糖耐受,发挥与脂联素(Adiponetin,ADPN)相似的功能[1]。其他研究还发现,该物质还具有ADPN 类似的舒张血管、抑制肿瘤生长等作用[2-3]。目前,AdipoRon已经商品化,作为ADPN 的替代品,它的方便性得到许多研究者的青睐,但它能否完全替代ADPN 发挥生物学调控功能还有待进一步验证。

ADPN 是一种多功能蛋白,不仅影响糖代谢,也调节骨代谢[4]。一些研究显示,ADPN 促进成骨细胞增殖和分化。在体外培养的人成骨细胞中添加重组ADPN 蛋白后,表现为细胞数量增加、碱性磷酸酶(ALP)活性提高、骨钙素(osteocalcin,OC)和Ⅰ型胶原(type Ⅰcollagen,COL1)表达量增加,且调节作用具有剂量和时间依赖性[5-6]。感染ADPN-腺病毒的小鼠骨小梁量增加,破骨细胞数量减少,血浆Ⅰ型胶原交联氨基末端肽(NTx,骨吸收标志物)水平降低,表明ADPN 可提高成骨细胞活性,减少破骨细胞数量和活性,增加骨量[7]。

与此相反的是,一些临床数据和实验室研究显示,ADPN 与骨密度和强度呈负相关。JURIMAE等[8]发现,ADPN 与骨矿物质含量、总骨密度及腰椎骨密度呈负相关。PENG 等[9]研究指出,ADPN 是中国男性骨密度的预测因子,ADPN 与总骨密度、腰椎骨密度、全髋关节骨密度均呈显著负相关,与ALP和COL1 呈明显的正相关,提示ADPN 可能不利于男性骨量增加。相似地,还有研究发现,ADPN 是小鼠骨矿物质和骨强度的负调节因子[10]。在没有超重的情况下,循环ADPN 升高会抑制生长中的小鼠获得骨量,并导致骨生物力学指标下降[10]。在大鼠中,ADPN mRNA 的表达量与股骨的极限弯矩、极限能量吸收和挠度呈正相关,与抗弯刚度呈负相关[11]。在没有支架材料的旋转共培养系统中共培养原代成骨细胞和破骨细胞,可获得骨样组织,该组织可用来评估各种化合物对机械强度的影响。体外三维人工骨模型验证发现,ADPN 可降低用上述方法获得的骨球组织硬度[11]。SHINODA 等[12]发现,ADPN 可通过自分泌/旁分泌和内分泌途径调节骨形成：自分泌/旁分泌产生的ADPN 可促进骨的形成；而内分泌产生的ADPN(循环ADPN)直接作用于骨,负调节骨形成,同时内分泌产生的ADPN还通过增强胰岛素信号,间接作用于骨,促进骨的形成。上述研究结果说明,ADPN 可通过不同的路径对骨代谢产生复杂的调节作用。

ADPN 可调节骨代谢,为研究骨代谢疾病的发病机理提供了一条新思路,但是ADPN 对家禽骨代谢影响还鲜见报道,而天然ADPN 难以大量的获得,不利于开展深入的研究和临床化应用。AdipoRon的研发弥补了ADPN 难以获得的缺点,方便了科学试验的开展。本试验通过体外培养成骨细胞,研究AdipoRon能否影响鸡成骨细胞增殖和凋亡,探讨脂肪因子ADPN 对家禽骨代谢的影响。

1 材料与方法

1.1 成骨细胞的分离和培养SPF 鸡胚孵育至14日龄,75%酒精擦拭鸡胚外壳,无菌取出鸡胚额骨,放入盛有PBS 液的平皿中；刮去额骨上的结缔组织,重复2次,直至额骨呈乳白色；将额骨放入冻存管中,加入2.5 m L 0.25%胰蛋白酶(Sigma,美国),37℃恒温水浴锅内孵育15 min,每隔5 min充分摇晃冻存管1次；弃上清,PBS清洗2次,加入2.5 m L 0.1% Ⅰ型胶原酶(Sigma,美国),并剪碎额骨,37℃恒温水浴锅内孵育50 min,每隔10 min充分摇晃冻存管1次；孵育后加入等量的含15%胎牛血清(四季青,浙江天杭生物科技股份有限公司)的DMEM/F12 细胞培养液(Gibco,Thermo Fisher Scientific,美国；含有100U/mL 青霉素,100mg/L链霉素,5000 mg/L 维生素C)终止消化。将液体移至离心管,加入5mL 细胞培养液后1500r/min离心15min；弃上清液,加入1mL 细胞培养液混匀细胞,用细胞计数板计数细胞数量,计算细胞浓度,调整细胞浓度至6×104细胞/mL。根据试验需求将其接种于96孔板或6孔板,在37℃、5%CO2条件下培养,24h后进行第1次换液,之后每隔48h换液,倒置显微镜拍照记录成骨细胞生长情况[13]。

1.2 细胞活性和增殖检测用含15%胎牛血清的DMEM/F12培养液培养成骨细胞72h后,添加终质量浓度为100mg/L或200mg/LAdipoRon的细胞培养液,并设对照组。继续培养72h 后,碱性磷酸酶(北京索莱宝科技有限公司,北京)染色检测6孔板中成骨细胞活性变化,MTT 染色检测96孔板

中细胞增殖率。

1.3 Real-timePCR 检测基因表达量收集6孔板中不同处理组的成骨细胞,PBS清洗2次,每孔加入500μLTrizol液(Invitrogen,ThermoFisherScientific,美国)作用5min；将细胞裂解液分装于1.5mL无RNA 酶管中,－80℃冻存过夜后,提取总RNA,反转录合成cDNA；利用核酸蛋白仪(IMPLEN P33O,德国)检测其质量和浓度,Real-timePCR 仪(CFX96TouchTMReal-time,美国Bio-Rad 公司)分析成骨细胞相关基因的表达量。

数据采用△Ct定量分析法进行相对定量分析,分别计算AdipoRon组和对照组的基因AdipoR1、AdipoR2、OC、COL1A2、Caspase-3、Bcl-2、Bax与内参基因β-actin(表1)相对比值,计算公式为：

表1 引物序列及扩增片段长度

1.5 数据统计与分析使用SPSS22软件方差法进行数据统计与分析,结果以平均数±标准差表示,P＜0.05表示差异显著,P＜0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 细胞形态学观察细胞形态观察发现,与对照组(图1A)相比,加入100mg/L AdipoRon(图1B)培养48h 后,细胞形态较为正常,细胞核可见,但成骨细胞数量减少；而添加200mg/LAdipoRon的细胞(图1C)正常形态消失,体积减小,细胞核明显固缩。

2.2 碱性磷酸酶(ALP)活性检测ALP染色发现,3个组细胞质中ALP 染色颗粒无明显差异。对照组成骨细胞(图2A)分布密集,细胞呈多边形。与对照组相比,100mg/LAdipoRon处理后的成骨细胞(图2B)数量明显减少,但仍呈正常细胞形态；添加200mg/LAdipoRon(图2C)的成骨细胞正常形态消失,体积狭长,细胞质减少,细胞核明显固缩。

2.3 细胞增殖率检测MTT 法检测成骨细胞增殖率,结果显示,分别添加100,200 mg/L AdipoRon均显著抑制鸡成骨细胞的增殖(P＜0.01)。

图1 AdipoRon 对鸡成骨细胞的作用(48 h,100×) A.对照组；B.100 mg/L AdipoRon组；C.200 mg/L AdipoRon组

图2 碱性磷酸酶染色观察(100×) A.对照组；B.100 mg/L AdipoRon组；C.200 mg/L AdipoRon组

图3 AdipoRon 对成骨细胞增殖的影响 注：与对照组相比,大写字母不同P＜0.01

2.4 成骨细胞相关基因的相对表达量与对照组相比,AdipoRon处理组成骨细胞的AdipoR1/2 表达量均极显著上升(P＜0.01,图4),且呈现明显的剂量依赖性,200 mg/L AdipoRon 组的Adipo R1/2表达量比100 mg/L Adipo Ron 组极显著或显著上升(P＜0.01 或P＜0.05)。AdipoRon处理后成骨细胞特异性表达基因OC 表达量显著上升(P＜0.05),且呈剂量依赖性,但对COL1A2的表达量无显著性影响(P＝0.41)。与对照组相比,100 mg/L AdipoRon 组的Bax 和Bcl-2 表达量差异不显著(P＞0.05),而200 mg/L AdipoRon 组的Bax 和Bcl-2表达量极显著上升(P＜0.01),且200 mg/L AdipoRon 组的Bax表达量相较于100 mg/L AdipoRon 组极显著上升(P＜0.01),但AdipoRon处理对成骨细胞Bcl-2与Bax表达量的比值(即Bcl-2/Bax)无 显 著 性 影 响(P＝0.85)。AdipoRon 组Caspase-3 的表达量均极显著高于对照组(P＜0.01),且200 mg/L Adipo Ron组的Caspase-3表达量比100 mg/L AdipoRon 组极显著上升(P＜0.01)。

3 讨论

在本试验中,添加AdipoRon后进行细胞形态学和ALP染色观察,发现鸡成骨细胞正常形态发生变化,成骨细胞数量减少,说明AdipoRon可能不利于鸡成骨细胞的增殖。MTT 检测结果也证实,添加100 mg/L 的AdipoRon即可引起成骨细胞的显著减少,进一步研究证明AdipoRon不利于成骨细胞的增殖。细胞形态学和ALP染色观察发现,添加AdipoRon出现了细胞核固缩,核固缩是细胞凋亡的特征之一,提示Adipo Ron可能加速鸡成骨细胞的凋亡。但是,添加AdipoRon并未影响ALP染色细胞阳性率,ALP 是成骨细胞的特异性分泌蛋白,是成骨细胞分化的标志物[14],因此,AdipoRon可能并未抑制成骨细胞的分化。

基因定量表达研究显示,AdipoRon显著增加鸡成骨细胞AdipoR1/2基因表达,证明AdipoRon能激活鸡成骨细胞的AdipoR1/2。ADPN 通过与AdipoR 结合调节机体的各种代谢,而AdipoRon也能直接激活成骨细胞AdipoR1/2,提示AdipoRon 可发挥与ADPN 类似的作用,激活成骨细胞AdipoR的作用,科学试验中可使用AdipoRon代替ADPN研究其对鸡成骨细胞的作用及机理。

图4 不同质量浓度AdipoRon对成骨细胞基因表达量的影响 注：组间比较大写字母不同示P＜0.01；小写字母不同示P＜0.05

OC 是由成熟成骨细胞和骨细胞特异性合成和分泌,是骨组织中非胶原性蛋白的主要成分,是成骨细胞成熟的标志基因之一[15-16]。Ⅰ型胶原(collegeⅠ)是鸡骨骼中含量最为丰富的胶原蛋白,对骨的结构框架和强度至关重要[17]。本研究中,AdipoRon显著促进鸡成骨细胞OC 基因的表达,且呈剂量依赖性,而对鸡成骨细胞COL1A2基因的表达无显著性影响；表明AdipoRon可促进鸡成骨细胞的成熟。

Bcl-2蛋白家族由抗凋亡(Bcl-2、Bcl-x L、Mcl-1、A1等)和促凋亡(Bax、Bcl-xS、Bak、Bad等)成员组成。Bax 是一个21 k Da 蛋白,与Bcl-2 同源。当Bax在细胞中过度表达时,会加速细胞凋亡,被称为凋亡激动剂。当Bcl-2过表达时,它会与Bax形成异质二聚体,从而抑制细胞的凋亡；因此,Bcl-2 与Bax的比值在决定细胞凋亡敏感性方面具有重要意义[18]。此外,Caspases家族是细胞凋亡的重要介质,其中Caspase-3是一种常被激活的凋亡蛋白酶,催化许多关键细胞蛋白的特异性裂解,对于凋亡染色质凝聚和DNA 裂解是必不可少的,在细胞凋亡过程中起着重要的作用[19]。许多证据表明,破坏线粒体功能(如跨膜电位缺失、渗透性改变和细胞色素C的释放导致电子转运受损)在许多细胞凋亡中起着重要作用。由多种凋亡信号(如Bax)诱导的细胞色素C的释放会激活凋亡活化因子1(Apaf-1)和Caspase-9复合物,从而激活Caspase-3,引起细胞凋亡；然而,也有证据表明,Caspase-3的激活也可以独立于线粒体细胞色素C 的释放而发生,如已经发现了2种由Fas受体发出的细胞类型依赖性的凋亡途径[19]。本试验发现,AdipoRon处理鸡成骨细胞,对细胞Bcl-2/Bax指数无显著性影响,但使细胞促凋亡基因Caspase-3的表达量极显著上升,且呈剂量依赖性；表明100,200 mg/L AdipoRon可促进细胞的凋亡,且呈剂量依赖性。该基因表达结果与试验中的细胞形态观察和ALP 染色观察到的核固缩的结果相吻合。

因此,本研究结果表明,Adipo Ron可刺激AdipoR1/2基因表达,发挥与ADPN 类似的生理学功能,且呈剂量依赖性抑制鸡成骨细胞的生长,促进成骨细胞调亡。该结果与王亭[20]的试验相似,他们的研究中也显示AdipoRon也呈剂量依赖性抑制小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1 的增殖,诱导细胞的凋亡。但是,该试验结果与LUO 等[5-6]利用ADPN 的试验研究不完全一致,他们研究发现,体外培养的人成骨细胞中添加重组ADPN 蛋白后,可通过MAPK信号通路促进细胞增殖与分化,表现为细胞数量呈剂量和时间依赖性增加。其最可能的原因是AdipoRon或者ADPN 对成骨细胞的影响具有种属差异性,更多的体外和体内试验需要进一步开展。本试验也为进一步研究ADPN 对鸡骨代谢的作用、探明鸡骨代谢疾病机理及其防治方法的建立等提供新的思路。