迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC原核表达及其免疫原性

张志强,杨 楠,李永慧,苏硕青,吴同垒,康元环,王洪彬,朱国强,史秋梅∗ (.河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室,河北 秦皇岛066004；.秦皇岛第二医院,河北 秦皇岛066604；.吉林农业大学动物科学技术学院,吉林 长春08；4.扬州大学 兽医学院,江苏 扬州5009)

迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda,E.tarda)感染在水产养殖中十分普遍,能够引起多种海水和淡水鱼类感染发病[1],尤其是在我国鲽、鲆、鳗等经济鱼类产区危害严重,造成十分重大的损失[2]。该菌1962年首次由日本学者从患红点病鳗鲡体内分离,此后发现其能够感染包括鱼类、两栖类、爬行动物、鸟类和哺乳动物在内的多种类型宿主动物[3]。更应引起重视的是,E.tarda可以感染人,病型复杂[4-5],严重可诱发致死性败血症,近年来通过食源途径感染病例急剧增多,揭示其重要的公共卫生学意义[4,6-7]。

在实际生产中,利用传统抗生素和化学药物方法防控E.tarda感染效果不确定,难以根除,同时造成的菌株耐药和水体污染情况不容忽视[8],这些问题已成为渔业生产上的重大困扰。目前针对E.tarda感染疫苗研究仍处于初步阶段,虽然目前已有获批生产的商用疫苗,但其多局限于鲆鱼使用,对其他鱼类效果未知。此外该菌疫苗的开发存在难以克服的问题,一方面灭活疫苗免疫效率低下,免疫效果差强人意[9-10]；另一方面,基因工程减毒疫苗虽免疫效果优良,但安全问题不容忽视。因此,基于保护性抗原筛选研究的亚单位疫苗和活载体疫苗研究成为研究的热点[11-13]。TolC 是存在于革兰阴性菌细胞外膜上的通道蛋白与Arc A 和ArcB 形成三聚体形式,发挥质子泵功能,在细菌对抗不利环境过程中发挥关键作用[12-13]。关于该蛋白,大多数研究聚焦于其具有的参与毒力、与细菌抗逆特性,而有研究表明沙门菌TolC 是其保护性抗原,能够有效防护沙门菌对动物的侵袭[14],揭示了其潜在的应用价值,但关于其免疫保护效果的研究很少。

本研究针对生产上日益严重的E.tarda感染问题,对其外膜通道蛋白TolC 进行原核表达和纯化,并进一步利用动物试验评估该重组蛋白的免疫原性和免疫保护效果,为进一步研制E.tarda亚单位疫苗和核酸疫苗靶点选择奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒与实验动物E.tardaET-13强毒株由东南大学高大庆教授提供；E.tarda感染小鼠阳性血清(抗体效价为1∶1 600)、原核表达载体p ET32a由河北科技师范学院动物传染病研究室制备保存；禽呼肠孤病毒His-sigmaC由河北科技师范学院动物传染病研究室保存。6～8 周龄清洁级昆明小鼠,购自中国医学科学院实验动物研究所,试验前在动物隔离器自由采食1周,以适应环境。

1.2 酶及其他试剂DH5α、BL21感受态细胞由河北科技师范学院制备,－70℃分装保存；LA Taq DNA 聚合酶购自Ta KaRa(大连)；限制性内切酶及T4连接酶均购自Thermo公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；His标签单克隆抗体(His-MAb)、HRP 标 记 山 羊 抗 小 鼠IgG 抗 体(HRP-IgG)、IPTG 及Ni＋agrose填料购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.3 E.tarda tolC 基因序列分析根据GenBank上发布E.tarda参考菌株ET-1 基因组序列(CP001135.1)设计扩增tol C基因引物。引物P1：5′-ATGAAGAAACTGCTCCCTC-3′；引 物 P2：5′-TACGCCGCCACCGGGGATC-3′。以E.tarda基 因组为模板PCR 扩增tolC基因,将目的基因与p MD18-T 载体连接构建p MD18-T-tol C,连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,挑取单克隆菌落进行PCR 检测,阳性菌落由生工生物公司进行序列测定。从GenBank上寻找E.tarda参考菌株及其他肠杆菌科细菌tol C基因序列,分析其同源性。

1.4 重组表达载体的构建根据UniProt网站E.tarda的TolC蛋白特性注释,该蛋白含有22 个氨基酸残基的信号肽分子,可能影响蛋白的原核表达或产量,本研究设计引物去除TolC 蛋白信号肽部分仅对其成熟体进行表达。P3：5′-CGGGATCCGAAAACCTGATGCAGGTATATC -3′,带有Bam HⅠ酶切位点；P4：5′-GCGTCGACAGCCTGCGGCTGAGTAAC-TTC3′,带有SalⅠ酶切位点。以p MD18-TtolC为模板,P3、P4 为引物扩增目的基因,回收片段与p ET-32a载体分别进行双酶切,将目的基因和p ET-32a载体片段回收,按照3∶1比例连接,转入DH5α感受态细胞中,挑取克隆进行PCR 验证,阳性克隆提取质粒进行双酶切验证和序列测定,无突变和移码即得到重组表达载体p ET-32a-tolC。

1.5 His-TolC蛋白原核表达及验证将重组载体p ET-32a-tolC和空载体分别转化入BL21 工程菌中,挑取单菌落接种含有氨苄青霉素(50μg/L)的液体LB培养基中,37℃振荡培养至D600值为0.8～1.0,加入终浓度为0.5 mmol/L 的IPTG 诱导蛋白表达,37℃振荡培养4～6 h,离心收集菌体。菌体沉淀PBS洗涤3次后,重悬,按比例加入4×Loading Buffer,充分混匀后煮沸10 min,离心,收集上清液即为蛋白样品。利用SDS-PAGE 分析蛋白表达,随后以His-MAb为一抗(1∶1 000)、HRP-IgG 为二抗(1∶5 000),用Western blot方法进一步确认目的蛋白表达。

1.6 目的蛋白的可溶性分析及纯化将重组菌株按照上述条件进行扩大培养,离心收集菌体；利用超声破碎仪破碎菌体,离心分离沉淀、上清,将细菌裂解物、上清以及沉淀分别制备蛋白样品,利用SDSPAGE分析目的蛋白在上清和沉淀中的含量。

本研究中重组TolC 蛋白为包涵体表达,利用分子克隆指南描述方法纯化包涵体蛋白,利用紫外分光光度计测定纯化蛋白浓度,分装,于－70℃保存。

1.7 重组TolC蛋白免疫保护试验参照文献描述方法[15-16],将40只健康昆明小鼠随机分成2组,每组20只。首免肌肉注射50 μg重组TolC 蛋白(弗氏完全佐剂乳化),间隔2周后二免(弗氏不完全佐剂乳化),首免后30 d以弗氏不完全佐剂乳化蛋白加强免疫；对照组小鼠3 次免疫均注射等体积的PBS。首免后48 d对2 组小鼠腹腔接种E.tardaET-13菌液,剂量为5 LD50(2.0×107CFU),感染后观察4 d,统计死亡数量。

1.8 免疫小鼠血清抗体水平的检测在小鼠免疫前后不同时间点,以眶下窦采取小鼠血液并分离血清,以纯化的重组TolC 蛋白作为包被抗原,利用间接ELISA 方法[15-16]检测小鼠血清抗体效价,以阴性血清D450nm平均值加3 倍标准差作为阴阳性判定标准。

2 结果

2.1 tolC 基因克隆与重组表达载体p ET-32a-tolC的构建利用PCR 方法扩增tolC完整ORF,并将其克隆到p MD18-T 载体上,由生工生物公司测序,将测序结果与E.tarda其他菌株tolC基因参考序列比对分析显示(图1),爱德华菌属成员间tol C基因高度保守,但与大肠杆菌、沙门菌等其他肠杆菌科细菌同源性低。

图1 不同菌株tolC 基因同源性分析

以p MD18-T-tol C为模板PCR 扩增用于表达的tolC片段(图2),大小为914 bp。将目的基因克隆到载体p ET-32a上,所得重组载体p ET-32a-tol C经Bam HⅠ和SalⅠ双酶切鉴定,出现大小与PCR结果一致的条带。基因测序结果无突变移码。

2.2 融合蛋白His-TolC 的表达验证将重组表达载体p ET-32a-tol C转至BL21中,加入IPTG 诱导表达重组蛋白,利用SDS-PAGE 检测蛋白表达。结果显示,在68 000处诱导表达出目的蛋白(图3A),以His-MAb为一抗、HRP-IgG 为二抗进行Western blot鉴定,同样于68 000处出现目的条带,证明重组蛋白His-TolC能够表达。

图2 PCR 扩增大肠杆菌tolC 基因 M.DL2000 DNA Marker；1.tolC 基因

图3 His-TolC蛋白的表达验证 A.SDS-PAGE 分析His-TolC 在大肠杆菌中的表达；B.Western blot鉴定His-TolC 在大肠杆菌中的表达。M.Perstained protein Marker；1.pET-32a-tolC/BL21；2.p ET-32a-tolC/BL21；3.p ET-32a/BL21

2.3 His-TolC蛋白的可溶性分析及纯化将阳性表达菌株扩大培养,收集菌体,超声破碎,对菌体裂解物、上清和沉淀成分进行检测,结果(图4A)表明重组蛋白主要存在于沉淀中,且以包涵体形式表达。对包涵体进行纯化,获得较为纯净的重组蛋白(图4B),测定蛋白质量浓度为0.94 g/L。

图4 His-TolC蛋白的纯化 A.SDS-PAGE分析大肠杆菌表达His-TolC 的可溶性；B.SDS-PAGE 分析His-TolC 的纯化效果。M.Perstained protein Marker；1.Lysate of induced p ET-32a-tolC/BL21；2.Soluble component of bacterial lysate；3.Sediment component of bacterial lysate；4.Lysate of induced PET-32a-tolc/BL21；5.Purified protein His-TolC

2.4 动物免疫试验结果利用Western blot分析发现(图5A),E.tarda感染小鼠阳性血清可以特异性识别重组His-TolC蛋白。

将重组蛋白免疫小鼠,并于三免后15 d对所有组小鼠以5 LD50E.tarda活菌进行腹腔攻毒,120 h内观察并记录每组小鼠的死亡情况。结果显示,对照组小鼠全部死亡,免疫组小鼠1只死亡,其余小鼠在经历短暂精神沉郁、食欲不振后逐渐恢复健康。结果表明(图5B),His-TolC 重组蛋白免疫小鼠后具有一定保护力,保护率为95%。

2.5 免疫小鼠血清抗体水平的检测结果将4 次采集的血清按1∶200 进行稀释,以500μg/L 重组蛋白包被酶标板,以羊抗鼠IgG-HRP 为二抗进行间接ELISA 检测(图6)。结果表明：重组蛋白免疫小鼠能够产生较高水平特异性抗体,于加强免疫后达到最高水平。

3 讨论

E.tarda是一种重要的人畜鱼共患胞内寄生菌,该菌在渔业生产中十分普遍,危害严重,传统抗生素和化学药物治疗效果不佳,目前已成为困扰水产养殖最重要病原之一[8]。疫苗安全高效,是农业养殖疫病防控的重要手段之一,为水产上各类病原感染的防控提供了参考和借鉴。寻找E.tarda保护性抗原,并在此基础上开发亚单位疫苗和核酸疫苗用于该病防控是目前的研究热点[12-13]。

图5 His-TolC蛋白对小鼠免疫保护力 A.Western blot分析阳性血清对His-TolC蛋白的识别；B.His-TolC蛋白对小鼠的免疫保护效果。1.His-TolC protein；2.His-sigmaC protein of avian reovious

图6 免疫小鼠血清的抗体水平变化

TolC是革兰阴性细菌上的外膜通道蛋白,最早被认为是大肠杆菌膜表面的“耐受”受体,介导大肠杆菌对细菌素的吸收；随后发现该蛋白在革兰阴性菌中普遍存在,参与细菌对抗生素、胆盐、酸性环境等不利环境的耐受[17]。目前关于TolC的研究多集中在其参与形成的多药外排泵,TolC 蛋白能够与特异性内膜复合物结合组成主动外排泵,如Acr ABTolC、Mac AB-TolC,对于细菌多重耐药的形成具有重要意义[17]。除此之外,TolC 还与多种细菌生理活动相关,如参与细菌代谢废物排出,维持细胞生理稳态[17]；有研究发现,TolC 参与细菌生物膜结构的形成[20],但其生物学功能有待于进一步深入探索。除此之外,TolC也是一个优良的保护性抗原。在沙门菌上的研究发现TolC 蛋白免疫小鼠后能够有效防护沙门菌感染,保护率达85%[14],但在其他细菌上该蛋白的免疫保护效果尚未见有报道。本研究以E.tarda外膜通道蛋白TolC 作为研究对象并尝试对其进行原核表达和纯化,获得了高纯度重组蛋白。以纯化的重组TolC 蛋白进行Western blot操作,用E.tarda感染动物阳性血清作为一抗孵育,发现重组蛋白能够被阳性血清特异性识别,证明在E.tarda感染过程中TolC 蛋白参与激发特异性免疫反应,可能是E.tarda的一个保护性抗原。在进一步动物试验中,利用重组TolC 蛋白免疫小鼠,通过检测血清中针对该蛋白的特异性抗体水平,证明该蛋白具有极好的免疫原性。TolC 蛋白免疫小鼠后以5 LD50E.tarda强毒菌株接种能够有效降低小鼠感染死亡率,免疫保护效果确实(95%),证实其潜在的疫苗价值。当然,一个抗原由实验室走向临床要经历漫长验证历程,本研究结论尚有诸多有待完善之处,如小鼠与鱼类免疫器官有较大的差异,TolC蛋白是否在鱼类上有如此优良的效果? 疫苗生产中多使用氢氧化铝和白油作为佐剂,以这二者作为佐剂TolC 蛋白是否依然具有可观的免疫效果? 这些都有待于我们进一步的研究验证。

本研究以E.tarda外膜通道蛋白TolC 为研究对象,对其进行原核表达和纯化,Western blot结果证明自然感染中该蛋白能够诱导宿主产生抗体,并进一步通过动物试验评估该蛋白具有较好的免疫原性和体液免疫效果,为进一步研制E.tarda亚单位苗和活载体疫苗提供参考。