马抗埃博拉病毒免疫球蛋白F(ab′)2的制备及效果评价

刘 媛,李 敏,杨晓岚,范铁炯,李 晓,张华捷,李 靖,闫 芳,赵忠鹏∗ (1.山西农业大学 动物科技学院,山西 太谷00800；.军事医学研究院 微生物流行病研究所 病原微生物生物安全国家重点实验室,北京100071；.上海赛伦生物技术股份有限公司,上海0118；.中国食品药品检定研究院,北京100050)

埃博拉病毒病(Ebola virus disease,EVD)是埃博拉病毒(Ebola virus,EV)感染所致的一种急性烈性传染病,是病死率最高的自然疫源性和人兽共患性传染病之一,病死率可高达90%[1]。EV 包括5种亚型,埃博拉-扎伊尔(Ebola-Zaire,Z-E)、埃博拉-苏丹(Ebola-Sudan,S-E)、埃博拉-科特迪瓦(Ebola-Coted’Ivoire,C-E)、埃博拉-莱斯顿(Ebola-Reston,R-E)和埃博拉-本迪布焦(Ebola-bundibugyo,B-E)。其中以Z-E的毒力最强,人感染后死亡率最高；S-E次之；C-E对黑猩猩有致病性,对人则毒力最弱；RE、B-E 对人不致病,但对人以外的灵长类动物具有致死性[2]。有研究表明5种亚型病毒之间仅有较弱的交叉免疫保护性[3]。自2013年12月西非疫情暴发以来,累计死亡人数已经超过10 000人。2014年8月8日和2019年7月17日,世界卫生组织2次宣布西非EVD 疫情为“国际公共卫生紧急事件”,引起了国内外媒体、公众、学术界和产业界的广泛关注。随着我国对外交流的日益频繁和商贸的不断扩大,EVD 随时面临输入风险,对其防治药品研发迫在眉睫[4]。

疫苗和治疗性抗体是应对突发传染病公共卫生事件的重要手段。目前,美国Mapp Biopharmaceutical公司研发的针对EVD 的单抗混合物ZMapp,即便在EV 感染后5 d内注射ZMapp,也能完全保护受攻击的非人灵长类动物[5],使其症状明显改善并完全康复,并且治愈了2名EV 感染的援非美国医务人员,暗示中和抗体有望成为防控EVD 的一线药物。但是,单抗混合物ZMapp抗原表位覆盖率低,产能过低,限制了此类产品在临床上的广泛应用。近年建立的新一代抗血清(马抗免疫球蛋白F(ab′)2)制品不仅充分发挥传统马抗血清制品抗原表位覆盖率高、产能大的优点,而且制品活性高、纯化好,显著降低副作用,使安全性进一步提高,已成为异源治疗性抗体的发展方向。

病毒样颗粒(VLP)疫苗是新一代的疫苗类型,能诱导机体产生较强的体液免疫和细胞免疫。研究表明,EV 的G 和VP40蛋白能自组装成VLP,是制备治疗性抗体优良的免疫抗原之一[6]。假病毒单次感染细胞后,荧光素酶活性被表达,并且其表达量与假病毒进入细胞的数量成正相关。目前,利用假病毒系统,已经建立了高致病性禽流感病毒、中东呼吸综合征病毒等多种烈性传染病中和抗体效价测定方法,摆脱了对烈性病原体和高等级生物安全实验室的依赖,成为研发烈性病原体疫苗和抗体的利器[7]。研究表明,EV 的G 蛋白与宿主细胞表面受体相结合启动了EV 感染侵染细胞的进程,利用假病毒包装系统和EV 的G 蛋白制备形成的EV 假病毒,能够完全模拟EV 侵染细胞的过程[8],成为评价疫苗和抗体效力的最廉价手段。

在已发现的5种亚型EV 中,Z-E 和S-E 对人的致病力最强,引起的疫情和病例数最多,也是目前埃博拉疫情防控的重点。本研究应用现代生物制药技术,从VLP 抗原表达、纯化、免疫方案优化和F(ab′)2纯化等各个环节进行优化,最终制备了马抗EV 免疫球蛋白F(ab′)2成品,通过安全性评价及利用假病毒进行的中和抗体效价测定表明该制品符合现行《中国药典》的要求,为EVD 下一步的治疗工作提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 基因、质粒、菌株和细胞Z-E 和S-E 亚型EV的G 和VP40蛋白,由苏州金唯智生物科技有限公司合成；p FastBac-Dual质粒及昆虫杆状病毒表达系统购自Invitrogen公司；p VAX1 质粒、p NL4-3.luc.RE购自北京英茂盛业生物科技有限公司；DH5α感受态细菌购自康为世纪生物科技有限公司；293T、Huh7细胞购自军事医学科学院微生物流行病研究所细胞库；Super SF-α昆虫细胞,广东华南联合疫苗开发院有限公司提供。

1.2 实验动物体质健康蒙古马,4～6岁,10匹,购自赤峰博恩药业有限公司,经检疫符合现行《中国药典》要求。

1.3 主要试剂及仪器细菌用培养基购自BD 公司；昆虫细胞用培养基购自Invitrogen公司；293T、Huh7细胞用试剂购自Gibco 公司；G 蛋白,S-E(40094-V08B1),Z-E(40442-V08B1),购自北京义翘神州生物技术有限公司；HRP Goat Anti-equine IgG(H＋L),购于欣经科生物技术有限公司；EV G蛋白单抗,批号SC-51872,购于Santa 公司；EV VP40蛋白单抗,批号ab1926,购于Abcam 公司；Goat Anti-mouse IgG(H＋L),购于鼎国生物技术有限公司；发酵罐购自广州奇志生物技术有限公司；区带离心机购自Beckman公司；ACTA Purifier900纯化仪购自Amersham Biosciences公司；层析填料购自GE公司；酶联仪购自Thermo Scientific公司；荧光素测定仪及试剂购自Promega公司；KH-2100薄层扫描仪购自上海科哲生化科技有限公司。

1.4 重组Z-E和S-E 亚型EV VLP 抗原的制备及检定登录NCBI网站,下载Z-E 和S-E 亚型EV的G 和VP40全基因序列,以时间最近的序列为参考,根据昆虫表达系统密码子优化基因序列,并结合质粒酶切位点人工设计序列,委托苏州金唯智生物科技有限公司全基因合成并委托Invitrogen公司测序；按照Invitrogen 公司Bac to Bac Baculovirus Expression Systems操作手册,将G 和VP40蛋白基因分别克隆入p Fast Bac-Dual质粒的Polh和p10表达盒,分别获得Z-E 和S-E 亚型EV 重组杆状病毒；蚀斑纯化重组杆状病毒,筛选高表达株后分别建立三级病毒种子批；在广东华南联合疫苗开发院有限公司GMP厂房,无血清培养基高密度发酵Super SF-α昆虫细胞后,将工作批毒种按0.1 MOI加入,2个/d罐体积灌流培养,12 h后开始收集灌流液直到96 h；300 000 Millipore超滤膜包浓缩100倍；蔗糖区带90 000 r/min离心6 h,分段收集蛋白峰；利用Sepharose 4FF凝胶层析,收集EV VLP 抗原蛋白峰。Lowry法测定抗原的蛋白浓度；SDS-PAGE、WB结合薄层扫描法、HPLC法测定抗原的纯度,透射电镜观察抗原的形态。

1.5 马抗EV 免疫球蛋白成品F(ab′)2原料血浆的制备将纯化重组Z-E/S-E EV VLP 抗原与等体积的弗氏不完全佐剂混合,乳化,经马颌下、腹股沟淋巴结至少10点注射免疫,前5次基础免疫剂量分别为3,3,5,5,7 mg,每次间隔21 d,末次免疫后14 d,测定中和抗体效价,血清效价不低于120/μL时,采血,分离血清。

1.6 马抗EV 免疫球蛋白F(ab′)2成品制备及检定

在上海赛伦生物技术有限公司GMP 厂房,按照建立的马抗免疫球蛋白F(ab′)2生产工艺进行,制备马抗EV 免疫球蛋白F(ab′)2成品。采用Lowry法测定免疫血浆和F(ab′)2的蛋白浓度；根据血浆的初始体积和F(ab′)2的最终体积计算终产品的蛋白质收率；按照建立的制品质量规程测定马抗EV 免疫球蛋白成品F(ab′)2纯度。

1.7 Z-E和S-E EV假病毒的制备及检定按照北京英茂盛业生物科技有限公司慢病毒包装手册操作并进一步优化,具体步骤如下：

将G 基因克隆入p VAX1 质粒的CMV 表达盒,分别获得Z-E和S-E 亚型EV 的G 蛋白真核表达质粒；在75 cm2的细胞培养瓶中,调整293T 细胞至合适浓度,加入20 m L包含10%热灭活的胎牛血清和1%双抗的DMEM 培养基,放于37℃、5%CO2培养箱培养；细胞达到70%～80%铺满时,换16 m L包含1%双抗的DMEM 培养基,放于37℃、5%CO2培养箱培养2 h；准备15 m L 的细胞管,依次加入4 m L Opti-MEM,80μL transfection reagent(LipofectamineTM2000),40μg HIV-1 plasmid(p NL4-3.luc.RE),40 μg Ebola-GP plasmid(p VAX1-GP),混匀30 s,室温静止20 min；将混合物加入293T 细胞,放于37℃、5%CO2培养箱；转染后12 h,用20 m L 包含1%双抗的DMEM 培养基取代以上转染培养基,放于37℃、5%CO2培养箱继续培养60 h；收集包含EBOV 假病毒的上清,并经0.2μm 滤膜过滤,分装,放于－76℃,待用。使用Huh7细胞,按照Reed-Muench法测定假病毒滴度。

1.8 假病毒测定马抗EV 免疫球蛋白F(ab′)2原料血浆和成品的中和抗体效价正式试验前先使用相同细胞、相同条件滴定假病毒8～10 次,取其平均值,求出每0.05 m L 中含40 000 荧光值的病毒载量,病毒回滴应在600～1 000 荧光值/μL。使用Huh7细胞,按照Reed-Muench 法,测定血浆和F(ab′)2成品分别对Z-E和S-E 亚型EV 假病毒的中和抗体效价。以抑制50%荧光值(病毒半数降落值)的血清最高稀释度为终点效价,判定最终结果。细胞对照正常,荧光值在0～2荧光值/μL,病毒回滴应在600～1 000荧光值/μL,其结果成立,若不在范围内,则试验无效,应重复试验。

1.9 ELISA 测定马抗EV 免疫球蛋白成品F(ab′)2原料血浆和成品抗体效价运用间接ELISA 方法,使用5 mg/L EV G 蛋白包被96孔酶联板,显色终止后,在酶联仪上,于450 nm,以空白对照孔调零后测各孔D450值,用统计软件Graphpad Prism 5,采用重复测量资料分析,以大于Cut off值＝2.1×N(N为阴性对照平均D值,如小于0.05按0.05计算)的抗体最大稀释倍数为该制品的ELISA 抗体效价。

1.10 安全性检测按照现行《中国药典》要求,部分委托北京昭衍新药研究中心,对马抗EV 免疫球蛋白F(ab′)2成品进行无菌试验、热原检查、异常毒性试验、一般药理试验、急性毒性试验、免疫毒性试验、溶血和血管刺激性试验。

2 结果

2.1 重组EV VLP蛋白制备及检定结果显示,经初步优化后,纯化的Z-E 亚型EV VLP 纯度均在95%以上,产能均在3 mg/L 以上,S-E 亚型EV VLP 纯度均在96%以上,产能均在4 mg/L 以上；电镜观察符合丝状病毒的形态,在蔗糖空隙中存在大量丝状物质,S-E与Z-E 亚型EV VLP 基本一致(图1)。

图1 EV VLP 检测结果 左.Z-E 亚型EV VLP SDSPAGE代表性结果；右.透射电镜图。1.重组EV VLP蛋白；M.标准蛋白质Marker

2.2 马抗EV 免疫球蛋白F(ab′)2成品的收率及纯度检测结果显示,纯化的马抗EV 免疫球蛋白F(ab′)2成品收率为1.5%左右,F(ab′)2纯度在90%以上(图2)。

图2 马抗EV 免疫球蛋白F(ab′)2成品检定结果

2.3 重组EV假病毒效价测定结果显示,Z-E和SE亚型EV假病毒滴度均在40 000荧光值/μL以上,能够满足制品中和抗体效价测定的要求(图3,表1)。

图3 EV 假病毒检测结果 A.EV 假病毒(1∶1 000稀释)荧光显微镜结果；B.红色激发光下观察结果

表1 3批Z-E、S-E EV 假病毒滴度结果荧光值/μL

2.4 EV 假病毒测定免疫血浆和马抗EV 免疫球蛋白F(ab′)2成品的中和抗体效价结果显示,中和抗体效价均超过100/μL(表2)。

2.5 ELISA 测定原料免疫血浆和马抗EV 免疫球蛋白F(ab′)2成品抗体效价结果显示,ELISA 效价均超过51 200(表3)。

2.6 马抗EV 免疫球蛋白F(ab′)2成品的安全性

按照现行《中国药典》要求,部分委托北京昭衍新药研究中心,开展了无菌试验、热原检查、异常毒性试验、一般药理试验、急性毒性试验、免疫毒性试验、溶血和血管刺激性试验,试验结果均符合现行《中国药典》要求,具有良好的安全性。

表2 3批血浆和F(ab′)2成品中和抗体效价结果

表3 3批血浆和F(ab′)2成品ELISA 效价结果

3 讨论

自1976年首次分离到EV 以来,西非EVD 疫情一直呈规模不大的散发状态,没有引起应有的重视,阻碍了对其防治药品的应用基础研究,国际社会迄今没有可用的药物对EVD 进行有效防治。2013年12月以来暴发的西非EVD 疫情,给学术界、产业界和医学界再度敲响了警钟,EVD 防治药品研发已是刻不容缓。从发病的严重程度、频次和规模来看,Z-E和S-E亚型EV 是目前EVD 疫情防控的重点。

治疗性抗体是当今重大疫病防控的“杀手锏”,从治疗狂犬病、蛇毒的多抗到治疗各种癌症、自身免疫病等的单抗[9],治疗性抗体的制备经历了直接输注康复者血浆,输注免疫异源动物后制备的抗血清,输注单克隆抗体,输注人源化抗体,4 个阶段。目前,上述各类抗体制备技术仍在产业界广泛应用,拥有几十种产品。而免疫异源动物后制备抗血清技术也经历了传统的整个抗体分子,发展到有效去掉能引起毒副作用的Fc片段抗体分子和其他血浆外源因子,获得具有与病原体特异结合的高纯度F(ab′)2新一代抗血清治疗性抗体。我们在SARS[10]、H7N9[11]治疗性抗体研发的基础上,创建了具有自主知识产权的新一代治疗性抗体研发平台,EVD 疫情暴发后,遂开展了EV 治疗性抗体的研发,从检测结果看,抗体活性好、纯度高、蛋白含量少、中和效价高且安全,已达到美国FDA 对同类制品的质量要求,有望为埃博拉出血热的“应急治疗”提供特效药。

治疗性抗体研发最核心最关键的环节是免疫抗原的选择和制备。不同的研究团队在DNA 疫苗、病毒活载体疫苗、病毒样颗粒疫苗方向都进行了有益的探索。在基因疫苗研究方面,EV G 蛋白是最有可能引发中和抗体的病毒蛋白,是唯一已知的位于病毒颗粒表面的糖蛋白,并且在细胞培养中发现EV 单克隆抗体有中和病毒感染的作用,在食蟹猴和短尾猴体内均诱发了保护性免疫,在Ⅰ期临床中也显示了良好的结果[12]；在病毒活载体疫苗研究方面,构建了EV G 蛋白重组黑猩猩腺病毒活载体疫苗,并在猕猴动物感染模型研究中展现了保护作用[13]；在VLP疫苗研究方面,利用杆状病毒昆虫细胞表达系统获得了EV 病毒样颗粒,能够产生中和性抗体和有效保护。但作为中和性抗体的诱导剂,DNA 疫苗抗原免疫原性过小,用量大；病毒活载体疫苗抗原含有载体病毒的成份,安全性受限；而VLP疫苗作为新疫苗类型,免疫原性好,无外源因子,是最佳的选择。我们选择昆虫杆状病毒表达系统制备EV VLP抗原,其纯度均在95%以上,产能均在3 mg/L以上,形态符合丝状病毒特征,达到了现行《中国药典》对免疫用抗原的要求。如果对表达盒启动子、偏嗜密码子序列等进行优化[14],有可能进一步提高产能,降低产品的成本,相关工作目前正在进行中。

对外来烈性病原体防治产品开发的瓶颈是依赖高等级生物安全实验室和无病原体,借助假病毒技术建立了EV 中和抗体测定方法,突破了该瓶颈。我们制备的假病毒效价均在40 000荧光值/μL 以上,半年内效价维持不变,达到了测定用病毒的要求,利用800(600～1 000)荧光值/μL假病毒测定中和效价,抗体效价稳定、可靠,并且与ELISA 效价具有一定的正相关性。目前,在BSL-4中,利用EV 活毒,测定F(ab′)2成品的中和抗体效价和对EV 模型动物的保护试验正在筹备中。

综上所述,利用现代生物制药最新技术,我们成功制备了马抗EV 免疫球蛋白F(ab′)2制品,有望成为Z-E 和S-E 亚 型EVD 的“救 命 药”,本 研 究 为 相关临床前研究和临床试验准备工作提供理论基础。