水貂细小病毒MEV-LT18株的分离鉴定及遗传进化分析

朱翔宇,鲁荣光,王 洋,卜 研,蔡熙姮,柏 玲,侯金利,李滋睿,胡 博∗,闫喜军 (.中国农业科学院 特产研究所,吉林 长春02；2.农业农村部经济动物疫病重点实验室,吉林长春02；.辛庄畜牧兽医中心站,山东 烟台26540)

水貂细小病毒(mink enteritis virus,MEV)属于细小病毒科(Parvoviridae)、细小病毒属(Parvovirinae),是引起水貂病毒性肠炎的病原。水貂病毒性肠炎是一种急性、高度接触性,以剧烈腹泻为主要特征的严重危害养貂业的重要传染病之一[1]。1949年加拿大学者SCHOFIELD[2]首先发现MEV感染并命名为貂传染性肠炎,1952 年WILLS[3]提出引起本病的病原为病毒,并命名为水貂细小病毒。1981年,我国姜延秀等[4-6]首次报道我国发现疑似水貂病毒性肠炎疫情,随后该病逐渐蔓延至国内各水貂养殖省份,给养貂业造成巨大经济损失。流行病学调查结果显示,水貂病毒性肠炎的暴发呈季节性、地方性和周期性等特点,且MEV 具有强大的抵抗力,可以在兽笼和土壤中存活一年,病毒传播可通过直接接触感染水貂或间接接触污染饲养器具、工作人员和饲料等,另外还发现昆虫、鼠类和鸟类也可作为机械传播媒介进行传播[7]。水貂病毒性肠炎是养貂业的重点防控传染病之一,尚无特异性治疗方法,定期预防免疫接种是降低发病率和死亡率的有效手段,但是仍有新的MEV 变异株的发现和流行,水貂病毒性肠炎的防控依旧面临严峻考验[8-10]。

MEV 为无囊膜单链负股DNA 病毒,基因组全长约5 kb,病毒基因组包含两个主要的开放式阅读框(ORF1和ORF2),3′端的为ORF1,编码DNA 转录与复制所需的非结构蛋白(non-structure protein)NS1和NS2,另一个开放式阅读框为ORF2位于5′端,编码组成衣壳的结构蛋白(structure protein)VP1、VP2[11]。VP2蛋白是组成核衣壳的主要蛋白,对细小病毒的抗原性、血凝性起重要作用,还具有识别宿主细胞受体、决定病毒组织嗜性的功能[12]。MEV 基因序列的差异主要为VP2 基因上的非同义置换,而VP2蛋白上一个或几个氨基酸的差异,都可能导致病毒的抗原性、宿主体内外嗜性、血凝性等生物学特性发生改变[13]。本试验从河北省某水貂养殖基地送检的腹泻水貂小肠及其内容物中分离到1株病毒,经过一系列鉴定确定分离株为MEV,命名为MEV-LT18株。血凝试验结果表明该毒株不能凝集猪红细胞。通过对该毒株的基因组编码区进行扩增及序列分析以了解该地区MEV 分子流行病学的变化趋势,为今后进一步研究MEV基因变异机制及水貂病毒性肠炎的诊断检测、疫苗免疫等提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 毒株及细胞株水貂细小病毒MEVB 株,猫肾传代细胞系(F81),MEV 单克隆抗体,由中国农业科学院特产研究所农业农村部经济动物疫病重点实验室保存。

1.2 主要试剂和仪器胎牛血清,HyClone公司产品；胰酶及MEM 培养基,Gibco公司产品；基因组提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒,购自北京全式金生物技术有限公司；DL2000 DNA Marker、LA Taq DNA 聚 合 酶、p MD18-T 载 体、大肠杆菌DH-5α感受态细胞购自宝生物工程(大连)有限公司；FITC标记的山羊抗鼠IgG(H＋L),Proteintech公司产品；凝胶成像仪,购自GE公司；透射电镜,购自Hitachi公司；组织研磨仪,购自Thmorgan公司；荧光显微镜,购自Leica公司；引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3 病料收集与处理病料采集自河北省乐亭县某水貂养殖基地,发病水貂主要表现为严重腹泻,疑似MEV 感染,采集病死水貂肠道组织及内容物,－80℃保存。取一小块肠道组织及内容物加入到适量无菌PBS中,充分研磨后反复冻融多次,10 000 r/min低温离心10 min,取上清加入双抗1 000 IU,0.22μm 滤膜过滤除菌后,－80℃保存备用,并分装200μL组织研磨液上清提取核酸用于PCR 鉴定。

1.4 病毒分离与培养采用同步接毒的方式,将处理好的病毒样品按1%的比例接种F81细胞,同时设正常细胞对照,培养液为含2% 胎牛血清的MEM,置37℃,5% CO2培养箱中培养。每日观察记录细胞病变(cytopathic effect,CPE),待80%细胞出现拉丝、脱落等典型CPE 现象时收获病毒,继续盲传3～5代,－80℃保存。

1.5 病毒DNA 提取与PCR 鉴定参照基因组提取试剂盒说明书提取病毒DNA。按照张海玲等[14]建立的水貂肠炎细小病毒PCR 检测方法,合成MEV 检测引物并以病毒DNA 作为模板进行PCR鉴定。反应体系总体积为25μL：模板2μL,LA Taq 1μL,10×LA Taq Buffer 10μL,上、下游引物各1μL,d NTP 1μL,加dd H2O 至总体积25μL。PCR 扩增程序：94℃预变性4 min；94℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸90 s,共30 个循环；最后72℃延伸10 min。反应所得产物使用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.6 病毒形态的电镜观察将第6代细胞培养物反复冻融3次后,取200 m L 病毒液,4℃10 000 r/min离心10 min,吸取上清并加入终浓度8%的PEG 6 000和3%的NaCl,混匀后4℃过夜,沉淀病毒粒子。4℃10 000 r/min离心90 min,弃上清,用1 m L STE缓冲液重悬沉淀[15]。取10μL病毒液滴于保鲜膜上,夹取碳包膜的铜网,用铜网正面接触液滴表面,吸附10 min后置于1%磷钨酸溶液上进行负染,用电镜观察病毒形态学特征。

1.7 血凝试验(hemagglutination,HA)参考中华人民共和国犬细小病毒病诊断技术国家标准[16],对部分条件稍作优化后使用96 孔微量血凝板进行HA 测定,每孔加入25μL p H6.4的PBS缓冲液,每排第1孔中加入25μL 的待检病毒液,混合均匀后吸25μL 至第2孔,依次倍比稀释至第11孔,吸弃25μL,第12孔作为红细胞对照；同时设立重复组和阳性对照组；每孔补加25μL PBS,接着每孔加入50μL 1%猪红细胞悬液,震荡摇匀,4℃静置1 h,待红细胞完全沉淀后进行判定。以50%红细胞凝集为终点并判断为阳性,对应的稀释倍数即为该病毒的血凝效价。

1.8 间接免疫荧光试验将F81细胞均匀铺在12孔板中培养至致密单层,按5%接种分离株病毒,37℃培养48 h；弃上清液,用PBS洗3次；加入4%多聚甲醛固定30 min,PBS洗3次；加入0.5% Tristone,室温10 min,PBS 洗3 次；加入5%脱脂乳,37℃封闭30 min；加入1∶40 稀释的小鼠单抗腹水,37℃孵育1 h,PBS洗3次；加入1∶100稀释的FITC羊抗鼠IgG 二抗,37℃避光孵育1 h,PBS洗1次,在荧光显微镜下观察。同时设2孔未接种病毒的细胞做为阴性对照。

1.9 病毒滴度及理化性质测定参照文献介绍的方法对病毒分别进行核酸型鉴定试验、乙醚敏感试验、耐酸性试验、耐热性试验[1]；利用Reed-Muench法计算试验处理前后病毒的滴度。

1.10 序列扩增及遗传进化分析

1.10.1 PCR 扩增 参照GenBank 登录的MEVLHV 株序列(KT899745),经比对利用Primer 5.0软件设计6 对特异性重叠片段引物P1-P6 进行MEV 编码区序列的扩增。PCR 反应体系为50μL：模 板2 μL,LA Taq 1 μL,10×LA Taq Buffer 10μL,上、下游引物各1μL,d NTP 2μL,加dd H2O至总 体 积50 μL。PCR 扩 增 程 序：94℃预 变 性4 min；94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸70 s,30个循环；72℃延伸10 min。反应结束后使用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.10.2 克隆测序及遗传进化分析 回收目的片段后分别连接到p MD18-T 克隆载体上,转化至DH-5α感受态细胞后均匀涂布于氨苄青霉素LB固体培养基,37℃过夜培养。挑取单个菌落于LB 液体培养基中扩大培养并进行菌液PCR 鉴定,提取阳性重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将测序正确的各个扩增片段利用DNAStar软件进行序列拼接,确定无误后上传到GenBank。通过NCBI网站在线Blast选取相似程度较大的序列对NS基因和VP2基因进行比对及遗传变异分析。用Meg Align程序对分离株序列与GenBank发表的典型参考株进行氨基酸序列比对分析,并利用Mega 5.0软件应用最大邻近(Neighuor-joining,NJ)算法分别构建系统发育树,以确定分离株与其他毒株及疫苗株的进化关系。

2 结果

2.1 PCR鉴定PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测,在573 bp处出现特异性条带,与预期目的条带片段大小一致(图1)。

2.2 病毒分离采用F81细胞同步接毒的方法,从病料中分离到1株MEV,命名为MEV-LT18。与正常对照组F81细胞相比较(图2A),接种MEV 后的F81细胞出现脱落、拉网结丝及变形等典型CPE(图2B)。收获每代病毒,冻融3～5次后保存于－80℃。

2.3 电镜观察取离心后的病毒培养液10μL,经磷钨酸负染处理,在电镜下观察到病毒样颗粒,直径约22 nm、无囊膜、呈二十面体对称结构,与细小病毒的形态和大小相符(图3)。

图1 MEV-LT18 株的PCR 检测结果 M.DL2000 DNA Marker；1.病料；2.阳性对照；3.阴性对照

2.4 血凝试验结果发现分离株第1～6代病毒培养液均不能使1%猪红细胞发生凝集,对照组MEV B株病毒培养液可以凝集猪红细胞,同时阴性对照成立。

2.5 间接免疫荧光结果荧光显微镜避光观察结果显示,分离毒株出现明显的绿色荧光,说明MEV呈阳性(图4A)；正常细胞对照几乎看不到荧光现象(图4B),证实了该分离毒株为MEV。

2.6 病毒滴度测定及理化性质鉴定结果利用Reed-Muench法计算所分离毒株的滴度,MEVLT18分离株病毒含量为10－4.19TCID50/0.1 m L。经5-IDUR 处理后其TCID50下降超过2个滴度,表明该病毒核酸为DNA 型。乙醚、耐酸和耐热处理后,其TCID50前后变化在1个滴度内,表明该病毒对乙醚、酸和热有较强的抵抗能力,以上特性均与细小病毒理化特性相符。

图2 MEV-LT18株感染F81细胞后72 h的形态观察 A.正常F81细胞；B.接毒后的F81细胞

图3 MEV-LT18株的电镜观察结果

2.7 序列测定及遗传进化分析使用DNAStar软件Seq Man工具将测序结果进行序列拼接,最终得到一段总长4 739 bp 的序列,上传至GenBank(MK333230)。通过NCBI线上Blast功能寻找与MEV-LT18株NS基因和VP2碱基序列相似度较高的多个序列,通过Clustal W 方法进行碱基序列同源性分析。结果显示,MEV-LT18株NS基因碱基序列与MEV-SD12/01、MEV-LHV、MEV-SD07/09、SMPV-11 株的同源性最高,皆为99.95%,而VP2基因碱基序列与MEV-HLJ、MEV-Jilin2010株完全一致。

使用最大临近法(NJ法)对26株MEV 的NS基因和50株VP2基因分别进行系统进化树分析,结果显示,MEV-LT18 株NS 基因与MEV-SDNH株同源,形成一个进化分支(图5A),MEV-LT18株VP2基因与MEV-HLJ、MEV Jilin2010、SMPV-11株同源,形成一个进化分支(图5B)。

通过Clustal W 方法比对氨基酸序列,与Abashiri株对比,结果显示在NS 基因上有3 处氨基酸发生非同义替换,分别为aa10(Val→Ile)、aa540(Val→Ala)、aa574(Val→Ile)(表1)；在VP2基因上共有4 处氨基酸发生非同义替换,分别为aa232(Ile→Val)、aa236(Thr→Ser)、aa300(Ala→ Val)、aa411(Ala→Glu)(表2)。

图4 间接免疫荧光法鉴定结果 A.MEV 感染的F81细胞；B.正常细胞

表1 MEV 的14个毒株NS基因核苷酸和氨基酸序列比对

表2 MEV 的14个毒株的VP2基因核苷酸和氨基酸序列比对

图5 基于NJ法的MEV NS基因和VP2基因的系统遗传进化树,使用Mega 5.0软件(带有1000个引导应用程序)显示引导支持(85%以上) A.NS基因；B.VP2基因；▲.MEV-LT18

3 讨论

本试验利用F81细胞成功分离得到1株细小病毒,通过PCR 鉴定、电镜观察、HA-HI、间接免疫荧光等鉴定方法确定分离毒株为1株水貂细小病毒,命名为MEV-LT18株,基因组编码区序列总长为4 739 bp。遗传进化分析结果显示,MEV-LT18株的NS 基因和VP2 基因分别与MEV-SDNH 株和MEV-HLJ株处于同一进化分支,有可能是处于两者自然进化的过渡阶段的毒株,推测可能由于近年来水貂跨区引种导致貂群流动性增加所导致。

试验发现MEV-LT18株不具有凝集猪红细胞的能力,近年来报道的自然无血凝性细小病毒VP2蛋白的aa77、aa88、aa370、aa375、aa377等位点发生突变可能与病毒的宿主范围、抗原特异性及病毒的血凝特性方面有关[17-18]。而MEV-SDNH 株被证实为自然丧失血凝性的毒株,并推测可能与aa236(Thr→Ser)、aa300(Ala→Ile)、aa413(Asp→Asn)及aa426(Asn→Lys)的突变有关[19],但MEV-LT18株只有aa236 位点的氨基酸与其相同；因此,MEVLT18株丧失血凝性的具体原因需要进一步探索。常用的MEV 病原检测方法为血凝试验、胶体金试纸条及PCR 鉴定,血凝试验因操作条件简单、成本低,在基层检测中十分受欢迎[20],血凝特性的丧失对MEV 疫情监测工作的开展造成了一定的影响。

此外,序列分析发现MEV-HLJ株疑似为疫苗株与野毒株的重组毒株。目前,对于细小病毒引发的疾病仍无理想的特效药物,有效防控MEV 的唯一途径是疫苗免疫。但是,作为一种容易发生变异的DNA 病毒,生态环境变化引起的自然变异和在不同宿主体内的基因重组都有可能导致病毒序列的改变[21]。近年来不断有细小病毒突变株和重组株被分离[22-24],随着病毒的传播与扩散,一旦在某一地区暴发疫情,很难保证市场现有的疫苗能够提供有效保护。

随着现代水貂养殖业的多元、快速发展,规模养殖、集约化养殖都使水貂的养殖环境得到了改善,但对于MEV 的防控仍不可忽视,需要密切关注其在时间、地域及宿主等方面的流行病学调查情况,及时了解MEV 进化、变异的现状和发展趋势,为研究MEV 遗传进化规律奠定基础。

综上,MEV-LT18株符合我国目前流行的细小病毒的特征,为水貂细小病毒的流行病学调查提供了有效信息,同时也为今后开展水貂细小病毒分子病毒学、诊断研究及疫苗免疫提供了一定的理论依据。