NF-κB 和MAPKs在肥大细胞应答重组FMDV VP1-VP4蛋白过程中的作用

崔 川,刘佳欢,宋佳诚,梁慧婷,张义明,李丽敏,王家鑫 (河北农业大学 动物医学学院,河北 保定071000)

口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)感染偶蹄动物所引起的一种急性、热性和高度接触性传染病。FMDV 有7 种血清型(A、O、C、AsiaⅠ、SAT1、SAT2、SAT3)及多种亚型,我国主要流行为A 型、O 型以及AsiaⅠ型[1-2]。目前,国内外仍无理想的疫苗用于FMD 的预防[3]。灭活疫苗主要诱导体液免疫应答,但针对不同血清型FMDV 的抗体没有交叉保护作用,不能形成免疫记忆,需要多次接种,并因此导致过敏反应致死动物的情况时有发生[4],而且疫苗接种也不能阻止FMDV 对牛的感染和持续感染状态的形成[5]；因此,安全有效的FMD疫苗研制仍是一项很有挑战性的课题。

肥大细胞(mast cells,MCs)主要分布于皮肤和黏膜的结缔组织中,是Ⅰ型过敏反应的主要效应细胞[6]。近年的研究发现,MCs可表达Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)、甘露糖受体(mannose receptor,MR)、巨噬细胞半乳糖型凝集素(macrophage galactose-type lectin,MGL)、清道夫受体(scavenger receptor,SR)和NOD 样受体(NOD-like receptor,NLR)等模式识别受体,藉此识别病毒、细菌、真菌和寄生虫等病原体[7]。MCs不但可以通过吞噬或非吞噬途径杀死病原体[8],而且在病毒感染的识别和调节抗病毒免疫应答方面亦起着十分重要的作用[9]。在登革热病毒感染早期,肥大细胞迅速脱颗粒,随后病毒通过RLR 和MDA5 受体激活MCs,使 其产生TNF-α、IFN-α、CCL5、CXCL12 和CX3CL1,将NKT 细胞和NK 细胞招募至病毒感染部位,从而发挥其免疫监视作用[10]。AL-AFIF等[11]发现,用少量的呼吸道合胞体病毒感染MCs即可诱导其产生Ⅰ型干扰素、CXCL10、CCL4 和CCL5。有研究将MCs分泌的肝素、TNF-α与壳聚糖按一定比例制成颗粒作为佐剂,与流感病毒的血凝素混合制成疫苗免疫小鼠,可显著增强适应性免疫应答,从而抵抗致死量的病毒攻击[12]。FMDV 主要通过有大量MCs分布的咽部黏膜感染家畜[5],但目前对MCs在抗FMDV 感染中的作用尚不清楚。

研究发现,抑制MCs的TLR2和TLR4后负载重组VP1-VP4蛋白,MCs脱颗粒水平升高,抑制甘露糖受体后IL-6和TNF-α等细胞因子表达水平升高[13]。甘露糖受体是C型凝集素家族的成员,可识别包括甘露聚糖、病毒结构蛋白在内的组分,从而活化Syk,导致下游信号分子CARD9/Bcl10/MALT1募集,直接活化核转录因子NF-κB,或经由MAP激酶(MAPKs)活化转录因子AP-1,从而改变TNF-α、IL-6、IL-23等细胞因子基因的表达,发挥抗病毒感染的作用[14-15]。

本研究分别使用NF-κB 抑制剂或MAPKs抑制剂处理小鼠腹腔肥大细胞(p MCs),通过检测p MCs 分 泌TNF-α、IL-6 和IL-10 的 水 平,揭 示p MCs识别重组VP1-VP4蛋白分泌TNF-α、IL-6和IL-10的信号转导途径,以期为FMD 新型疫苗的研制提供新思路与新方法。

1 材料与方法

1.1 试验动物6～8周龄的SPF 级C57BL/6 小鼠(11400700272257)购自北京维通利华试验动物有限公司,饲养在独立通风鼠笼中。

1.2 主要试剂重组O 型FMDV 的VP1-VP4蛋白由本实验室制备并保存；NF-κB抑制剂与MAPK抑制剂分别为Enzo Life Sciences公司和Medchem Express公司产品；小鼠IL-6、IL-10、TNF-α 定量ELISA 检测试剂盒均购自美国R&D Systems公司；新西兰胎牛血清购自美国Thermo Fisher Scientific公司；Percoll分离液购自Solarbio公司。

1.3 重组O 型FMDV 的VP1-VP4蛋白制备近来认为,疫苗的有效免疫保护作用依赖中和抗体的产生、活化的T 细胞应答和效应免疫记忆[16]。GUZMAN 等[17]报 道,FMDV 的VP1 可 以 诱 导 动物产生中和抗体和具有交叉保护作用的CD8＋T 细胞应答。VP4 富含T 细胞表位,在不同血清型的FMDV 中高度保守,并可与牛群中多种单体型的MHC结合[18]。因此,我们设想,将整个VP1 蛋白与整个VP4蛋白连接在一起,有可能刺激动物产生对7种血清型FMDV 具有交叉保护作用的保护性免疫应答。VP1-VP4 蛋白按本实验室建立的方法制备[19]。

1.4 腹腔肥大细胞(p MCs)的收集与鉴定使用70%percoll分离液分离p MCs[20]：以颈椎脱臼法处死小鼠,腹腔注射5%DMEM 4 m L,并且轻按腹部数次；收集小鼠腹腔液,室温下以1 700 r/min 离心5 min；弃去上清液使用70%Percoll分离液按照每只小鼠1.6 m L 的量使细胞沉淀重悬；将5%DMEM 按照每只小鼠0.4 m L的量轻轻滴加到细胞悬液上部,室温下以3 000 r/min离心15 min；弃去上清液,使用5%DMEM 按照每只小鼠2 m L 的量使细胞沉淀重悬,室温下以1 700 r/min 离心5 min；弃去上清液,使用5%DMEM 使沉淀细胞重悬,再进行纯度、活力检测[21]。

1.5 抑制p MC NF-κB和MAPKs与负载重组FMDV VP1-VP蛋白将收集的小鼠p MCs浓度调至2.5×105个/m L,在24 孔细胞培养板上按照每孔1 m L 接种,并在相应的培养孔分别加入NF-κB 抑制剂(终质量浓度为50 mg/L)和MAPK 抑制剂(终质量浓度为10 mg/L),放入37℃、5% CO2培养箱培养45 min；然后,再在细胞培养板中加入重组FMDV VP1-VP4 蛋白,使其终质量浓度为20 mg/L,并设立空白对照组(MCs没有进行任何处理)及重组VP1-VP4负载p MCs组,分别记为MC组(空白对照组)、MC＋VP1-VP4 组(重组VP1-VP4负载p MCs组)、MC＋iNF-κB＋VP1-VP4 组(抑制NF-κB 组)和MC＋iMAPK＋VP1-VP4 组(抑制MAPKs组)。每个组每个时相设置3个重复孔。将细胞培养板放于CO2培养箱中培养,于负载重组VP1-VP4 蛋白后1,6,24,48 h收集细胞上清液放入―20℃备用。

1.6 细胞培养上清中细胞因子的检测分别使用小鼠TNF-α、IL-6、IL-10 ELISA 定量检测试剂盒进行测定。具体操作方法按照说明书进行：购买的检测试剂盒中ELISA 板已包被相应蛋白。使用稀释剂稀释标准品,设置不同浓度的标准品和对照品,在相应孔中加入标准品、对照品、样品各50μL,封板,并轻轻敲打微孔板1 min使其完全混合后,放置室温孵育2 h；甩去微孔板中的液体,将稀释好的洗液按每孔加入400μL,3 min/次,甩掉液体,在滤纸上拍干,重复洗涤5次；分别加入配好的Mouse TNFαConjugate、Mouse IL-6 Conjugate及Mouse IL-10 Conjugate,100μL/孔,封板,室温孵育2 h,甩去微孔板中的液体,按照以上的方法洗板5次；每孔加入100μL 的反应底物,在避光、常温条件下孵育30 min；每孔加入100μL 的终止液,轻轻敲击微孔板以确保彻底混合,在30 min 内使用酶标仪检测450 nm 与570 nm 的D值。

1.7 统计学处理细胞因子ELISA 检测的标准曲线使用ELISACalc软件绘制,ELISA 检测结果使用Graph pad prism 5.0 绘图并使用Two-way ANOVA 进行统计学检验。

2 结果

2.1 腹腔p MCs的分离与鉴定对使用70%percoll分离液分离得到的p MCs进行甲苯胺蓝染色,可见胞质呈深紫色,细胞膜清晰完整,无脱颗粒现象,基本处于未活化状态,纯度可达95%。全自动细胞计数仪测定结果显示p MCs的细胞活力可达92%。用FMDV VP1-VP4 蛋白负载p MCs可引起脱颗粒,细胞染色变浅(图1)。

图1 小鼠腹腔p MCs的鉴定(400×) A.未刺激的p MCs；B.VP1-VP4 刺激的p MCs

2.2 不同处理组p MCs上清液中IL-6、IL-10和TNFα的标准曲线分别以IL-6、IL-10和TNF-α标准品的浓度为横坐标,D值为纵坐标,使用ELISACalc软件进行4参数Logistic曲线拟合,绘制各自标准曲线(图2)。得到回归方程分别为：IL-6,y＝(A―D)/[1＋(/C)B]＋D(A＝9.279 56,B＝－0.968 26,C＝2 515.738 01,D＝－0.013 16,R2＝1.000 00)；IL-10,y＝(A－D)/[1＋(/C)B]＋D(A＝6.474 49,B＝－0.925 88,C＝6 671.048 72,D＝0.000 19,R2＝0.999 72)；TNF-α,y＝(A－D)/[1＋(/C)B]＋D(A＝5.377 02,B＝－1.244 86,C＝1 108.770 45,D＝0.007 04,R2＝0.999 97)。其中,各标准曲线的R2均大于0.99,可用此标准曲线计算各样品中相应细胞因子的含量。

2.3 不同处理组p MCs上清液中TNF-α的水平

用ELISA 检测试剂盒检测p MCs上清液中TNF-α的水平(图3)。结果显示,在1 h时,MC组与MC＋VP1-VP4组有极显著性差异(P＜0.01),MC＋VP1-VP4组与MC＋iMAPK＋VP1-VP4组有显著性差异(P＜0.05)。在6 h 时,MC＋VP1-VP4 组TNF-α的水平显著高于MC＋i MAPK＋VP1-VP4组(P＜0.01)。在24 h时,MC＋VP1-VP4组与MC＋iNF-κB＋VP1-VP4组有显著性差异(P＜0.05),MC＋VP1-VP4 组与MC＋i MAPK＋VP1-VP4 组有极显著性差异(P＜0.001)。在48 h 时,MC＋VP1-VP4组与MC＋iNF-κB＋VP1-VP4 组有极显著性差异(P＜0.001),MC＋VP1-VP4 组与MC＋i MAPK＋VP1-VP4 组有极显著性差异(P＜0.001)。以上结果表明PMCs识别重组FMDV VP1-VP4 蛋白分泌TNF-α主要是受MAPKs和NF-κB调节的。

图2 TNF-α、IL-6和IL-10的标准曲线

图3 各组不同时间点的p MCs培养上清中TNF-α的含量

图4 各组不同时间点的p MCs培养上清中IL-6的含量

2.4 不同处理组p MCs上清液中IL-6的水平用ELISA 检测试剂盒检测p MCs上清液中IL-6的含量(图4),结果显示,在6 h时,MC组与MC＋VP1-VP4组、MC＋VP1-VP4组与MC＋i MAPK＋VP1-VP4组均有极显著性差异(P＜0.001)。在24 h时,MC组与MC＋VP1-VP4 组、MC＋VP1-VP4 组与MC＋iMAPK＋VP1-VP4 组均有极显著性差异(P＜0.001)。在48 h时,MC＋VP1-VP4组与MC＋iMAPK＋VP1-VP4 组也有极显著性差异(P＜0.001)。而在24 h 时,MC＋VP1-VP4 组与MC＋iNF-kB＋VP1-VP4 组有显著性差异(P＜0.05)。以上结果表明,p MCs识别重组FMDV VP1-VP4蛋白分泌IL-6是受MAPKs调节的。

2.5 不同处理组p MCs上清液中IL-10的水平用ELISA 检测试剂盒检测p MCs上清液中IL-10的含量(图5),结果显示,在1 h时,MC组与MC＋VP1-VP4组有极显著性差异(P＜0.001),MC＋VP1-VP4组与MC＋iNF-κB＋VP1-VP4 组有显著性差异(P＜0.05),MC＋VP1-VP4 组与MC＋i MAPK＋VP1-VP4组有极显著性差异(P＜0.01)。在24,48 h,MC＋i MAPK＋VP1-VP4组的IL-10水平显著高于MC＋VP1-VP4组。结果表明,p MCs识别重组FMDV VP1-VP4 蛋白分泌IL-10 主要是受MAPKs调节的。

3 讨论

MCs主要分布在皮肤、胃肠道及生殖道黏膜上皮和鼻黏膜等病原微生物初次接触机体的场所,在抗细菌感染与抗寄生虫感染方面发挥着重要作用,但是MCs 的抗病毒免疫作用研究的很少[10-11]。FMDV 感染过程中重要的病原相关分子模式(PAMPs)包括病毒的结构蛋白。我们发现,抑制MCs的TLR2 和TLR4 后负载重组VP1-VP4 蛋白,MCs脱颗粒水平升高,抑制甘露糖受体后IL-6和TNF-α等细胞因子表达水平升高[13],而MCs分泌细胞因子等活性物质在决定树突状细胞抗原提呈方向及疫苗新型佐剂方面具有重要作用[12,21]。转录因子是MCs转录谱的关键调节因子,故通过抑制剂或RNA 干扰技术调节转录因子可以很大程度上调节MCs的功能[22]。所以,研究MCs识别重组FMDV VP1-VP4 蛋 白 分 泌IL-6、IL-10 和TNF-α的信号转导途径,对疫苗的合理设计具有重要的指导作用。

图5 各组不同时间点的p MCs培养上清中IL-10的含量

MAPKs为高度保守的真核生物信号转导酶,可以对细胞外刺激产生应答并调节多种细胞核内的事件。该家族包括胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基端激酶(JNK)和p38蛋白。MAPKs可以激活转录因子AP-1,而AP-1活化的相关蛋白在MCs活化的转录调控方面发挥着重要作用[22-24]。有研究表明,骨髓来源的MCs如果缺失ATF3(AP-1亚家族成员)对IgE-抗原的应答过程中脱颗粒水平降低,并且IL-4和IL-6水平升高[25]。NF-κB 是调节免疫应答相关基因的关键转录因子,其不仅可以诱导病原相关模式特异的细胞因子和趋化因子的表达,还可以调节某些特定基因的表达,在免疫应答过程发挥调节作用[26]。比如,NF-κB 可以调节MCs分泌TNF-α和IL-6的过程[27-28]。

为揭示小鼠p MCs识别重组FMDV VP1-VP4蛋白分泌细胞因子的机制,我们检测了抑制剂处理MAPKs和NF-κB 后IL-6、IL-10和TNF-α的分泌水平。使用SB 抑制MAPKs后,抑制MAPK 组IL-6、IL-10和TNF-α的分泌水平均低于重组VP1-VP4负载p MCs组,这就表明小鼠p MCs识别重组FMDV VP1-VP4 蛋 白 进 而 分 泌IL-6、IL-10 和TNF-α均通过MAPKs调节。使用SN50抑制NFκB后,抑制NF-κB组TNF-α和IL-6 的水平在24,48 h 均显著高于重组VP1-VP4 负载p MCs组,这就表明小鼠p MCs识别重组FMDV VP1-VP4蛋白进而分泌TNF-α和IL-6受NF-κB 调节,但除此之外,应该还有其他途径参与该过程的调节,这需要进一步的研究去证实。试验结果显示,NF-κB 对p MCs识别重组FMDV VP1-VP4蛋白分泌TNF-α和IL-6调节可能为负调节。尽管MCs的MAPKs调节促炎因子的研究已经很多,但是本研究表明小鼠p MCs识别重组FMDV VP1-VP4蛋白分泌IL-6和TNF-α,甚至抗炎因子IL-10,都是通过MAPKs调节的。需要值得注意的是,转录因子NF-κB 可能没有直接参与p MCs识别重组FMDV VP1-VP4 蛋白IL-10的表达调控。那么,到底是哪个转录因子参与p MCs识别FMDV V1-VP4 而分泌IL-10呢?从结果中可以看出,重组FMDV VP1-VP4蛋白对免疫应答具有一定的抑制作用,而抑制NF-κB后促炎因子表达反而升高,这表明重组FMDV VP1-VP4蛋白对免疫应答的抑制作用很可能与NF-κB参与IL-6及TNF-α的负调节有关系。毕竟,NF-κB还可以通过诱导IkB 家族成员表达、诱导IL-10分泌等途径负调节基因的表达[26]。而NF-κB 在小鼠腹腔p MCs应答重组VP1-VP4蛋白过程中如何发挥负调节作用需要进一步的研究。

综上所述,本研究表明小鼠p MCs 识别重组FMDV VP1-VP4 分 泌TNF-α、IL-6 和IL-10 经 由MAPKs调节以及IL-6和TNF-α的分泌还由NFκB调节,这为FMD 新型疫苗的研制提供了新思路与新方法。