一种改良型检测群体感应信号分子的TLC方法

王 艳, 张士春, 周 进

(1. 深圳职业技术学院，深圳 518055; 2. 深圳市水产行业协会，深圳 518055; 3. 清华大学 深圳研究生院, 深圳 518055)

群体感应(Quorum sensing，QS)是细菌间的密度调节信号，被视为细菌的通讯语言。根据细菌分类、信号分子和感应机制的不同，QS系统主要分为3类：LuxR/AI-I系统(主要是革兰氏阴性菌)，LuxS/AI-2寡肽类系统(革兰氏阳性菌为主、阴性菌为辅)，以及适应于种间交流的AI-3系统[1]。至今已确认多种AI-1和AI-2信号，如酰基高丝氨酸内酯(N-acyl homoserine lactones，AHLs)，寡肽类化合物、芳香醇类化合物、二酮哌嗪类化合物(Di-keto-piperazines, DKP)，2-庚基-3-羟基-4-喹啉 (2-Heptyl-3-hydroxy-4-quinolone)以及呋喃硼酸二酯(Furanosyl borate diester)等[2]。这些信号的存在可调节细菌的群体行为以应对环境的变化，包括生物荧光的产生、生物被膜(biofilm)的形成、毒力基因的表达以及环境条件的适应等[3]。

目前，以AHL分子为代表的AI-1类信号物是研究最为广泛的一种，大量应用于医学领域，如开发抗生素替代药品，合成AHL降解酶或阻断剂降低细菌的感染能力以及封闭有害菌的毒素分泌开关等[4]。此外，在医药中应用AHL系统的另一个典型例子是抑制微生物被膜的产生。微生物被膜的形成与病原菌的耐药性息息相关[5]，而AHL对细菌膜的形成、发展与成熟具有直接的调节作用[5]。因此，通过调控AHL系统来干扰病原菌生物被膜的形成是控制细菌性疾病的有效手段。近10年来，随着AHL认识的深入和学科交叉的发展，AHL的应用领域得到进一步延伸，已扩展到污水治理、海洋防污、生态修复以及健康养殖等领域[6]。

为了在微生物领域更多地挖掘和开发AHL菌株或AHL产物，针对AHL分子的有效检测成为人们关心的议题。目前用于检测AHL信号的方法主要包括生物检测和理化检测。前者主要是利用报告基因(如luxAB、lacZ及gfp等)构建生物感应器或报告菌株，如紫色色杆菌(Chromobacteriumviolaceum) CV026、根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens) A136和KYC55等，通过显色反应来判断信号的存在[7]。后者一般使用色谱技术，如液相色谱(HPLC)，该方法不仅能定量、定性分析信号分子的性质，同时还可以连接质谱、核磁共振来鉴定化合物的结构[8]。然而，HPLC操作复杂、费用昂贵、人员专业背景要求高，限制了其推广的步伐；另一种相对简单的色谱技术为薄层色谱(Thin Layer chromatograph，TLC)，它在精确性上虽不如HPLC灵敏，但是操作简单、使用灵活、无需昂贵仪器，在成本上具有显著优势，因而备受定性检测的青睐[9]。传统的TLC检测法，即采用报告菌株、水解显色剂X-gal以及半固体培养基三者混合后平铺于TLC板上，通过生物显色反应来进行AHL物质的判断。但该检测方法存在一些不足，包括显色不均匀、蓝色斑点有浸润、显色圈过大及视觉效果有偏差等问题。因此有必要进行优化与改进，建立一种更为有效、分辨率更高的检测技术。因此我们开发了一种基于制胶板的TLC方法，以期改观传统方法在操作程序和检测结果上的不足。

1 研究方法

1.1 菌株及试剂

实验中所用AHL检测菌株为根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens) A136 (pCF218)，培养条件为LB培养基(包含壮观霉素Sp 50 μg/mL 和四环素Tc 4.5 μg/mL)。另一种菌株为铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa) PAO1，它具有产C4-AHL和3-oxo-C12-AHL的能力，在本次实验中作为AHL模式菌株。

壮观霉素Sp、四环素Tc、X-gal(5-溴4-氯3-吲哚β-半乳糖苷)、AHL标准品C6-(货号10940-25MG)，3-O-C8-(货号17247-25MG)，C9-(货号17650-25MG)，C11-(货号10937-25MG)和C14-AHL(货号09139-25MG)购自Sigma公司，RP-C18 F254s 反相薄层板(TLC板)购自德国Merck公司。

LB(Luria-Bertani)液体培养基的制备，准确称取蛋白胨(Typtone) 1.0 g，酵母提取物(Yeast Extract) 0.5 g，氯化钠(NaCl) 1.0 g，加双蒸水(ddH2O) 至100 mL，充分混匀溶解，高压蒸汽灭菌(121℃)15 min。LB半固体培养基(软培养基)的制备采用在上述LB液体成分中加入1%的琼脂粉后灭菌制得。

其他化学试剂包括二甲基亚枫DMSO、乙酸乙酯、甲醇、乙醇以及醋酸等，均为分析纯，购置于上海国药试剂公司。

1.2 铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)PAO1 AHL化合物的抽提

将单克隆PAO1菌株接种于10 mL液体LB培养基中，过夜培养得到一级种子，将一级种子加入到含有500 mL LB液体培养基于30 ℃、220 r/min条件下扩大培养24 h。收集发酵液，4 ℃离心20 min(6000 r/min)，用0.22 μm的滤膜对离心的上清进行过滤除杂。收集到的上清液与乙酸乙酯1∶1混合，装于1L分液漏斗中充分混合，萃取30 min。获得有机相在旋转蒸发仪上进行蒸馏(45 ℃)，风干的抽提物用1 mL甲醇溶解，用1.0 μm的有机相滤膜进行过滤，得到AHL分子提取物。

1.3 制胶板的设计

根据待铺TLC薄层板的大小(20.0 cm×20.0 cm)，设计了一个外部尺寸为20.5 cm×20.5 cm的制胶板，其中内部使用面积20.2 cm×20.2 cm，四周带有凹槽(配有4根插条，插条高度0.5 cm)，用于制作半固体培养基的基座，具体如图1所示。制胶板的制作材料为有机玻璃(亚克力，型号PMMV-0A1，深圳)。

A：显示主板平面图和4根插条，主板四周设计有凹槽；B：显示安装好插条的平面图；C：示装好插条的侧方图

图1用于制备半固体培养基的制胶板

Figure 1 The preparing-gel plate for making the semi-solid medium

1.4 改良型TLC法的操作步骤

传统TLC法：将AHL标准品2～3 μL点样于C18反相薄层板上，以甲醇/水(60∶40，V/V)作为流动相充分展开后，挥干溶剂，按文献[7]的方法制备上层半固体培养基铺于TLC板上。简要操作方法如下：配置50 mL半固体LB培养基，灭菌后待冷却到45 ℃左右(避免琼脂凝结成块)，无菌操作将过夜培养的3 mL 根癌农杆菌A136菌液接入半固体培养基摇匀，再添加50 μL(60 μg/μL)的X-gal，轻摇后铺于TLC板上，置于28 ℃培养箱48 h后观察结果。此过程中根癌农杆菌A136作为报告菌株检测AHL信号，阳性为蓝色，阴性为无色。

改良型TLC法：按上述同样的方法点样、跑板、挥干后，将后续的程序分解成两步。操作方法如图2所示。首先，用冷却到45 ℃左右的100 mL半固体培养基与6 mL 根癌农杆菌A136菌株混合，轻轻摇匀后铺板，制备成厚度约为3～4 mm的薄层培养基，于室温冷却凝固。随后，用除菌硬质胶板托起整张凝固好的薄层培养基，一端轻轻接触TLC板，缓慢覆盖，以类似手机贴膜的方式向前平铺，直至整张培养基完好贴合于TLC板上方，操作过程注意排除气泡。最后，待贴合过程完成后，使用微生物涂布棒将100 μL浓度为20 μg/μL的X-gal均匀涂步于培养基上方，待X-gal液体吸收后，置于28 ℃培养箱，24～48 h后观察结果。

不同碳链长度的AHLs经薄层层析展开后，在有AHLs存在的区域会被报告菌株感应，并在X-gal存在的情况下呈现蓝色斑点。根据斑点的大小、位置、迁移率和颜色深浅可以定性AHLs的相对含量及其类别。

2 结果与分析

2.1 改良型TLC法显色斑点质量评价

以5种AHL标准品(C6-，3-o-C8-，C9-，C11-和C14-AHL)为材料，于薄层板上点样，对比传统方法和改良方法的差异。从对比结果(如图3)可以看出，方法优化后的斑点强度明显提高，斑点直径浓缩了1.4～1.9倍，薄层板迁移速率Rf的线性程度提高了30.5%。

A：准备45 ℃的水域环境;B: 准备100 mL 半固体LB培养基和5 mL过夜培养的A136菌株;C: 点好样的TLC板(20.0 cm×20.0 cm，流动相为甲醇∶水=6∶4);D: 插好叉条，制备半固体培养基胶片;E: 待培养基凝固后形成3～4 mm的薄片;F: 拆下插条;G：使用一张硬质塑料片贴于胶面，手托薄片将制胶板反扣，分离出完成的凝固培养基;H：将固体培养基薄片轻轻贴于TLC板上;I: 涂布X-gal

图2改良型TLC检测方法

Figure 2 The modified TLC method

A：传统型显色斑点，“1、2、3、4和5”为标准品(C6-，C9-，C11-和3-o-C8-，C14-AHL);B：改良型TLC法的显色斑点，1′、2′、3′、4′和5′所检测样品与A图对应。比较A、B 两图斑点直径，B图直径比A图缩小了1.4～1.9倍，灰度值提高；且线性迁移值Rf更好

图3改良型TLC法显色效果与传统型方法的比较

Figure 3 Comparison of the results between the modified TLC method and the traditional method

2.2 传统方法与改良方法的显色效果

比较了3种碳链长度(C6-，C9-，C11-)的AHL标准品和5种碳链长度的混合物(C6-，3-O-C8-，C9-，C11-和C14-)在两种方法下的显色效果。由对比结果(如图4)可知，单独点样时，改良型方法斑点扩散程度小，显色更清晰(图4-A)；混合样品下，改良方法显色分辨率更高，视觉反衬效果更明显(图4-B)。

2.3 以铜绿假单胞菌为例比较传统型和改良型TLC方法的效果

将铜绿假单胞菌的发酵液进行抽提，获得AHL粗提物，将改良型方法和传统型方法进行了对比，结果显示改良型方法显色视觉更美观，效果更清晰(图5)。该结果表明改良型方法不仅仅适用于标准品，也适用于天然来源的AHL提取物。

A:单独点样下两种方法的比较;B:混合点样下两种方法的比较。箭头所示为不同C链长度的标准物

图4两种方法的显色效果比较

Figure 4 Comparison of the difference of between using the two methods

左边示传统方法，右边是改良型方法。数字1～4为PAO1潜在的AHL分泌物，包括C4和3-O-C12

图5以PAO1抽提物为材料的两种方法比较

Figure 5 Comparison of the effects with the two methods taken PAO1 extract as the material

2.4 X-gal的用量对比

选用根癌农杆菌A136作为报告菌株进行X-gal用量的对比实验。传统的方法是将X-gal添加到半固体培养基中，使用剂量为：在50 mL软培养基中加入50 μL浓度为60 μg/μL的X-gal,按此剂量需要使用X-gal为3 mg(50 μL×60 μg/μL=3000 μg，即3 mg)。改良的方法是待培养基凝固后涂布，使用100 μL 浓度为20 μg/mL的X-gal，最终用量为2 mg。相比之下用量节省了三分之一，成本节省了33.3%(图6)。

图6 传统方法和改良型方法在X-gal用量消耗和薄层板上的迁移效果的比较

3 讨论

N-酰基高丝氨酸内酯类(AHL)化合物是革兰氏阴性菌中最重要的一类群体感应信号分子，调控多种生理基因的表达，参与菌群的多种生态功能。快速、简便、有效地检测AHL信号分子成为深入研究和了解细菌通讯机制的重要手段[10]。一些新的检测方法逐步开发，包括AI-1型和AI-2型[13-16]。目前利用报告菌株[如紫色色杆菌(Chromobacteriumviolaceum) CVO26、根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens) A136]和TLC方法进行偶联是检测 AHL 的有效手段，这主要得益于该方法简单、快捷和易得，不需要昂贵的设备[11]。然而传统的TLC方法在检测限和视觉分辨率上仍存在些许不足，未能充分发挥其作用，限制了检测范围的延生。前期的使用中也有作者指出分辨率有进一步提升的可能[12]。本实验在前人研究的基础上，改进了TLC方法的操作程序，通过设计制胶板将软培养基的制作与显色剂X-gal的涂布分成两步进行，有效避免了琼脂培养基在凝固的过程中对薄层板表面的浸润，使得蓝色斑点更为集中，减少了显色区域的弥散和拖尾，视觉分辨率更高。以AHL标准品为材料，将传统方法与改良方法进行Rf值和斑点形状的比较，发现斑点直径缩小了1.4～1.9倍，迁移率相关系数更接近于1。在实际的生物样品中(铜绿假单胞菌AHL产物)，进一步验证了改良法的敏感性和可行性，且证实该方法在检测混合样品中同样具有适应性。此外，对X-gal的用量减少了33.3%，有效地节省了实验成本。

本次优化的步骤中，体现了以下几点优势：首先，制胶板的设计保证了胶的质量，能轻松做到培养基无渗漏、无破损、无气泡，而且厚度均一，胶面平整；其次，待培养基凝固后再进行铺板，能有效减少凝固过程中水分在TLC薄层板上产生的张力，减少对待检AHL信号的稀释和扩散，保证局部的AHL物质维持原有浓度，致使显色点不分散，检测分辨率提高，视觉效果更好；最后，显色剂X-gal没有与待检的AHL物质直接接触，减少了假阳性结果的发生概率，使得检测的效果更能保真。综合来看，该方法在AHL标准品和铜绿假单胞菌PAO1抽提物中均得到了较好的验证，证实改良型TLC方法除了适用于单一样品，也适用于天然的混合物样品，提升了检测方法的有效性和普适性，具有广阔的应用前景。