Slug 敲除促进γ-射线照射小鼠肠上皮细胞损伤的体内研究*

李 鹏，朱庆丽，宁 亮，焦学龙，陈 栋，宫兴基，贺东勇

（青岛大学附属医院1 内分泌科；2 甲状腺外科；3 普外科；4 急诊内科，山东266003）

本课题组前期研究发现,靶向Slug 通过上调PUMA(p53 上调凋亡调控因子)增加体外肠道上皮细胞IEC6 对γ-射线照射的敏感性,而Slug 过表达保护细胞免于γ-射线照射引起的IEC6 损伤[1-2]。本研究旨在研究γ-射线对Slug 基因敲除小鼠模型肠道上皮细胞的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 以非Slug 基因敲除雄性C57BL/6小鼠为对照组,Slug 基因敲除雄性C57BL/6 小鼠为实验组,小鼠年龄4～6 周,体重16～20 g。Slug 基因敲除小鼠[SCXK(粤)2016-0041)]由南方生物模式研究中心完成,于青岛大学附属医院中心实验室饲养。受孕母鼠所生嵌合体小鼠可以成功将携带的Slug突变基因传代至杂合子。Slug 小鼠杂合子代符合孟德尔遗传定律,肉眼观察敲除小鼠无明显缺陷性表型,具有生育能力[3]。本实验使用的是Slug 基因敲除纯合子小鼠。

1.2 γ-射线照射 取非Slug 基因敲除C57BL/6 小鼠12 只,Slug 基因敲除C57BL/6 小鼠12 只,予以8Gy60Coγ 射线全身一次性照射,制作肠上皮细胞损伤小鼠模型。分别在照射后第1、3、8 天处死,取小肠于4%多聚甲醛液中固定,石蜡包埋,切片厚4 μm,常规HE 染色后观察肠道组织病理学变化。取非Slug 基因敲除C57BL/6 小鼠24 只,Slug 基因敲除C57BL/6 小鼠24 只,予以8Gy60Coγ 射线全身一次性照射,分别在照射后第2、4 和24 h 处死,检测细胞凋亡和PUMA 表达变化。

1.3 PUMA 免疫组化检测 将组织切片脱蜡,通过一系列二甲苯和乙醇洗涤再水合。在柠檬酸盐缓冲液中进行抗原回收,用过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性。将载玻片与小鼠抗人PUMA 单克隆抗体或正常小鼠IgG1 以1∶2 000 浓度一起温育过夜。载玻片洗涤后与生物素化的马抗鼠二抗孵育,随后与抗生物素蛋白-生物素复合物孵育,采用3,3′-二氨基联苯胺显色。阳性染色细胞≥10%为PUMA 阳性表达,＜10%为PUMA 阴性表达。

1.4 TUNEL 检测 石蜡切片贴在涂有粘合剂的载玻片上,58 ℃烤24 h,常规脱蜡至水。TUNEL 混合液1 mL 加入10 μL b-11-DUTP,10 μL TDT 进行孵育,37 ℃1 h,室温1 h,PBS 洗3 min×3 次。加Streptavidin-HRP 1 ∶400,37℃下30 min,PBS 洗3 min×3次。显色10 min,流水洗,苏木精衬染1min,盐酸乙醇分化,水洗,常规树脂封片。结果判断：显微镜下随机计数5 个以上高倍视野,不少于1 000 个细胞,褐色细胞为凋亡细胞。凋亡细胞数/总细胞数为凋亡指数(AI)。

1.5 统计学处理 应用SPSS 22.0 统计学软件分析数据。计量资料以±s表示,组间差异性比较采用ANOVA 分析和t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

图1 γ 射线照射引起小鼠肠上皮细胞损害

2 结 果

2.1 γ 射线照射对小鼠生存的影响 经8Gyγ 射线照射后,小鼠精神不振,进食量减少,Slug 基因敲除小鼠症状更明显。在照射后第1、3、5 天12 只非Slug基因敲除小鼠分别死亡0、1 和2 只,12 只Slug 基因敲除小鼠分别死亡2、4 和5 只,基因敲除小鼠死亡率91.67%,明显高于非基因敲除小鼠的25.00%,差异有统计学意义(P=0.004)。

2.2 γ 射线照射对小鼠肠道组织病理的影响 非Slug 基因敲除C57BL/6 小鼠在照射后第1 天肠道损伤较轻,照射后第3 天肠道损伤明显,至第8 天时损伤恢复。Slug 基因敲除C57BL/6 小鼠在照射后第1 天肠道损伤已明显,照射后第8 天损伤还未恢复(图1)。

2.3 γ 射线照射对小鼠肠道细胞PUMA 表达和细胞凋亡的影响 免疫组化检测发现,γ 射线照射后2小时在两组C57BL/6 小鼠肠道组织中PUMA 表达开始增加,8 小时时PUMA 表达最明显,24 小时后PUMA 表达恢复正常。TUNEL 检测发现,Slug 基因敲除小鼠在γ 射线照射后2 小时细胞凋亡指数已明显增高,8 小时时凋亡指数最高,而非基因敲除小鼠在照射后2 小时凋亡指数有所升高,8 小时时凋亡指数最明显,24 小时后两组小鼠凋亡指数明显下降。照射后2 小时(P＜0.01)、8 小时(P＜0.05)Slug 基因敲除组PUMA 阳性细胞比例及凋亡指数明显高于非敲除组,差异均有统计学意义(图2)。

图2 γ 射线照射对小鼠小肠窝细胞PUMA 表达和细胞凋亡的影响

3 讨 论

放射治疗是控制盆腔和腹腔肿瘤生长的重要治疗手段,但会引起一些严重的副作用,如放射性肠道损伤[4],如何减轻放射性肠道损伤是肿瘤放射治疗的重要课题。多项研究表明,通过基因改变可抑制射线引起的细胞凋亡,保护细胞和组织损伤[5-8]。

Slug 基因是转录因子Snail 家族中编码锌指结构蛋白的重要基因,通常在背部神经管表达,对神经胚胎形成具有至关重要的作用,并参与神经干细胞的正常发育[9]。本课题组前期研究发现,靶向Slug 增加放射引起的促凋亡蛋白PUMA 上调,导致细胞凋亡增加[10]。以体外培养的大鼠小肠隐窝上皮细胞ICE-6 为研究对象,将转染Slug siRNA 的细胞接受X 射线照射处理24 h,发现靶向Slug 诱导PUMA 蛋白表达增加,从而增强ICE-6 细胞对X 射线的敏感性,而Slug 过表达抑制PUMA 蛋白表达,降低ICE-6 细胞对X 射线的敏感性[1-2]。为进一步验证射线照射对肠上皮细胞的作用,我们建立了Slug 基因敲除小鼠模型[3]。本研究以8Gy60Coγ 射线全身一次性照射Slug 基因敲除C57BL/6 小鼠,以非Slug 基因敲除C57BL/6 小鼠作为对照,结果发现靶向Slug 小鼠在接受射线照射后肠上皮细胞损伤明显加重,上皮细胞恢复时间明显延长,小鼠死亡率明显增高,提示靶向Slug 促进肠上皮射线损伤。为进一步探究肠上皮照射损伤发生的机理,本研究检测肠上皮细胞凋亡和PUMA 蛋白表达。结果发现靶向Slug 小鼠受到射线照射后,凋亡细胞明显增多,PUMA 蛋白表达增多。综上所述,靶向Slug 可能通过上调PUMA 表达而加重射线引起的肠组织细胞损伤,Slug 过表达可减轻损伤,这为放射性肠道损伤的治疗提供了新的思路。