自组装膜进样质谱系统及其在砂质沉积物异化硝酸盐还原研究中的应用

谢成军，宋国栋，刘素美，唐继尧，张桂玲

( 1. 中国海洋大学 海洋化学理论与工程技术教育部重点实验室/海洋高等研究院，山东 青岛 266100；2. 青岛海洋科学与技术试点国家实验室 海洋生态与环境科学功能实验室，山东 青岛 266237；3. 中国海洋大学 化学化工学院，山东 青岛266100)

1 引言

氮是浮游植物生长的必要元素，在一定程度上限制着海洋的初级生产。然而，人类活动已经显著影响到自然界原有的氮循环[1]，使得近岸海区遭受诸如富营养化、底层水体缺氧和酸化等一系列生态环境问题[2–4]。边缘海沉积物是活性氮移除的主要场所，对于缓解近岸富营养化具有积极的意义[5]，同时对于评估全球海洋氮收支也至关重要[6]。沉积物中的活性氮移除主要依靠硝酸盐的异化还原过程实现，这些过程包括厌氧铵氧化和反硝化，在这两个过程中硝酸盐经过一系列异化还原最终以N2形式移除，在厌氧铵氧化过程中铵氮也被移除；同时，在沉积物中还存在异化硝酸盐还原为铵（Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium, DNRA）的过程，该过程仅仅是将硝酸盐转化为铵盐，并未实现活性氮的移除[7]。因此，准确量化边缘海沉积物中异化硝酸盐还原各个过程的速率，就成为准确评估海洋氮收支的关键所在。

目前对于海洋沉积物异化硝酸盐还原速率的测量，大部分的数据来源于泥质沉积物的研究，硝酸盐在泥质沉积物间隙水中的获取依靠扩散的途径。而近期的研究结果表明，砂质沉积物可能也是反硝化过程进行的热点区域，在这些沉积物中，硝酸盐通过平流输运进入沉积物，在发生反硝化时可能仍然处于氧化环境，这种反硝化被称为好氧反硝化[8–9]。而对于边缘海来说，大约50%～60%的区域被砂质沉积物覆盖，如果在这些砂质沉积物中能够发生好氧反硝化，则对于海洋氮循环的收支将会产生显著的影响[10–11]。然而，好氧反硝化在砂质沉积物中是否普遍存在，目前的研究中还尚存争议。

目前常用的测定沉积物异化硝酸盐还原过程速率的方法是基于15N 标记的技术[12]。在这种技术中，加入厌氧的沉积物中进行培养实验，然后在不同时间点取样，测定产物中29N2、30N2和对于产物测试的仪器一般采用气相色谱–同位素比值质谱[13–14]。该设备的成本在早期较高，这在一定程度上限制了该方法的推广。相对于同位素比值质谱，膜进样质谱是一种相对实惠且较为灵敏的一种小型质谱，已被国内外广泛应用于水体中多种气体的测定，如N2、O2和Ar 等[15–17]；该设备与15N 标记技术结合，不仅可以直接用来测定N2/Ar 从而直接计算N2产生的通量，而且也可以用来测量29N2和30N2，以及可以转化为29N2和30N2的15N 标记产物，具有快速、灵活、所需样品体积少等优点[15,18–19]，已经被许多氮循环研究学者用于沉积物或者水体中的反硝化、厌氧氨氧化以及DNRA，甚至沉积物固氮、矿化和铵同化等过程的研究[19–21]。国内的一些实验室已经配备了膜进样质谱，对于该设备的使用也有一定的介绍[16–17,21]，但大都是直接采购的商品化设备，成本依然较高，而且大多数的报道都没有涉及到仪器使用条件的优化，或者原本膜进样质谱的专门用途不适合15N 标记气体样品的测试，比如目前为走航用于水体的O2/Ar 测定的膜进样质谱，仪器自带的膜进样器扩散面积较大，需要200 mL/min左右的流速方能维持稳定的信号[17]，显然这并不适合小体积15N 标记氮气样品的测试。为此，在本研究中，我们利用现有的四极杆质谱仪，自行加工了由渗透性的硅胶薄膜管组成的膜进样器，组装了一套膜进样质谱系统，测试并优化其性能，并利用该系统初步研究了青岛石老人沙滩沉积物中异化硝酸盐还原过程。

2 材料与方法

2.1 自组装膜进样质谱系统组成

图1 展示了本研究自行组装的膜进样质谱系统。该系统主要由以下部件构成：样品瓶(S)，进样蠕动泵(P)，恒温水浴槽(T)，标准样品制作系统(R-E)，膜进样器(M)，冷阱(C)，铜还原炉(F)，离子源(I)，四极杆质量分析器(Q，英国Hiden 公司HPR40)，二次电子倍增检测器(SEM)和数据处理系统(D)。其中样品瓶用于盛放样品，我们选用国内外常用的Exetainer 瓶(6 mL或者12 mL，英国Labco 公司) 作为样品瓶；蠕动泵(Minipuls 2，法国Gilson 公司)负责将样品平稳地泵入膜进样器，以便于将水样中的溶解气体进行分离。膜进样器由渗透性的硅胶薄膜管组成(外径0.9 mm，长度3 cm)，其构造类似Kana 等[15]的膜进样器，该装置由作者在实验室自行加工而成。泵入膜进样器水样中的溶解的气体在膜外高真空的吸引下扩散至四极杆质谱系统管路中，高真空的获得由爱德华分子泵站实现，在测试时可维持10–7torr （1 torr=133.322 368 4 Pa）的真空度。为使水样中的气体能够均匀地透过硅胶半透膜，将膜进样器置于高精度(±0.01℃)恒温水浴槽中，以便于获得高精度的测试结果；此外，恒温水浴槽的另外一个功能是用来制取标准水样，即通过恒温搅拌水样使之与大气达到溶解平衡实现[15,21]。经膜进样器分离的气体(包含空气主要成分如N2、O2、Ar、CO2、H2O，以及15N 加富培养实验所产生的15N-N2、15NN2O 等)进入液氮冷阱后被纯化，一些高沸点的分子(如H2O、CO2、N2O 以及一些有机分子)在此被冷冻；经纯化后的气体主要含有N2(包含其同位素)、O2和Ar，然后气体样品继续进入还原铜炉(内含装有还原铜丝的石英管)，氧气分子与高温的铜丝反应被除去，以降低O2对测定30N2的干扰[22]。还原铜炉由石英玻璃管和可调温管式炉(温控范围：室温至1 000℃)组装而成。随后气体样品进入电离室，在此气体分子被高温钍化铱灯丝产生的高能电子流轰击而离子化，不同质荷比(m/z)的离子被四极杆质量分析器分离后经二次电子倍增检测器检测，然后经过信号收集系统记录信号传输到计算机进行处理。

图 1 自组装膜进样质谱系统示意图Fig. 1 Schematic diagram of self-assembled membrane injection mass spectrometry system

在使用之前我们首先对自组装的膜进样质谱系统的性能进行优化测试，这些测试包括系统的真空度，蠕动泵的进样流速和进样时间，进样时恒温槽的温度以及在测试29N2/28N2和30N2/28N2比值时是否受氧气影响。

2.2 蠕动泵进样流速和进样时间测试实验

利用20℃下与空气饱和的纯水采用蠕动泵进样，设定蠕动泵进样流速为0.40 mL/min，进样时间分别设定为2 min、2.5 min、3 min、3.5 min 和4 min，分别测定28N2、29N2和30N2的峰高值并计算对应的29N2/28N2和30N2/28N2的相对标准偏差，然后再更改蠕动泵流速分别为0.53 mL/min、0.67 mL/min、0.80 mL/min、0.93 mL/min 和1.07 mL/min，测试上述峰高值和对应的气体同位素比值，然后综合确定最佳的进样流速和进样时间。

2.3 进样温度测试

膜进样器对于水样中溶解气体的扩散受到温度的影响，一般说来，高温有利于扩散的进行，而低温会降低扩散速率。然而，温度并不是越高越好，较高的温度对于测试的精密度会产生一定的影响。将膜进样器置于高精度恒温槽中，分别利用10℃、15℃、20℃、25℃、30℃和35℃下与空气平衡的高纯水进样，时间为3.5 min，对比不同温度下N2和Ar 的峰高值并计算对应的N2/Ar 的相对标准偏差，然后评估最佳的进样温度。

2.4 氧气的干扰实验

在测试系统中安装铜还原炉。利用管式炉的升温程序分别控制还原铜丝的温度从室温到800℃变化，以此来检测进入质谱系统的氧气信号值与常温下的比较，并监测不同的加热温度下29N2/28N2和30N2/28N2的比值，以此来验证在测试29N2/28N2和30N2/28N2时氧气是否存在干扰。

2.5 石老人砂质沉积物15N 标记培养

为了探讨在砂质沉积物中的异化硝酸盐还原过程，于2017 年3 月在青岛石老人沙滩(36°06′04″N，120°29′12″E)获取砂质沉积物进行15N 标记的泥浆培养实验。样品采集后立即置于有冰袋的保温盒中带回实验室，然后进行有氧和厌氧条件的培养实验。对于厌氧培养，首先将混匀后的砂质沉积物装入3 个避光的气密性培养袋，加入氦气除氧的海水，原位温度预培养1 d，以消除培养体系中残余的溶解氧和硝酸盐(包括亚硝酸盐)。预培养结束后，分别向3 个培养袋中加入不同的标记物质，分别是：(1)，(2)+和混匀，使标记物质最终的浓度均为100 μmol/L。然后原位温度下培养8 h，分别在0 h、2 h、4 h、6 h 和8 h 利用注射器从培养袋中取样，取样前用手将培养袋混合均匀，待大颗粒物稍微沉降后，利用注射器抽取袋内泥浆样品注入1 个6 mL Exetainer瓶中，然后加入0.1 mL 饱和HgCl2用于终止微生物反应，样品避光倒置保存用于29N2、30N2以及的测定[23]。对于有氧培养实验，将混匀后的砂质沉积物装入避光的气密性培养袋，然后加入原位底层海水，并排出培养袋中的气泡，向培养袋加入使标记物质最终的浓度为100 μmol/L，混匀，原位温度下培养10 h，分别在0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h 和10 h 利用注射器进行取样，样品采集后分别转移至2 个6 mL Exetainer 瓶中，其中一个加入溶解氧固定剂，然后在24 h内用Winkler 法滴定其溶解氧含量[24]；另外一个加入0.1 mL 饱和HgCl2混匀加盖旋紧避光保存用于29N2、30N2和的测定。29N2与30N2样品的测试采用前面优化好条件的膜进样质谱以直接进样测试；测试采用碱性次溴酸钠氧化法首先将转化为29N2和30N2，然后再使用上述膜进样质谱进行测定。样品中29N2和30N2浓度的计算公式采用与Thamdrup 和Dalsgaard[25]类似的公式计算，

式中, ΔmN2表示29N2和30N2的产生 浓度；表 示29N2/28N2或者30N2/28N2比值；t0与ti分别表示培养实验的时间零点和取样时间点；表示ti时刻样品中28N2的信号值；α 是转化因子，即与空气饱和的水中溶解的N2单位浓度在膜进样质谱上产生的信号值。29N2和30N2的产率采用各自的浓度与时间的线性回归斜率获得；的浓度由转化后测出的29N2和30N2的浓度返算而得[19,23]，的产率由浓度随时间的线性回归斜率获得。15N 标记培养实验的产物随时间的变化采用单因素方差检验(One-way ANOVA)判断其随时间是否显著增加，利用Sigmaplot 软件完成。

3 结果与讨论

3.1 进样流速和进样时间对信号的影响

实验结果表明蠕动泵的进样流速和进样时间对于本实验室组装的膜进样质谱系统的信号值均产生影响(图2)。进样时间从2.5 min 到4.0 min，氮气的信号值均随着蠕动泵进样流速的增加而增加，在低泵速增加较快，在高泵速增加较为缓慢，在整个泵速范围内，28N2信号的响应值变化不超过20%，在进样流速0.80 mL/min 以上，无论进样时间长短，28N2的信号值在±2%波动。不同的进样时间在不同的蠕动泵进样流速下信号的响应值差别并不明显，说明2.5～4 min的进样时间都可以满足要求。29N2与30N2的信号值比28N2的信号值低2～3 个数量级，但均表现出与28N2类似的变化特征(图略)。

而对于29N2/28N2，无论进样时间长短，在中间进样流速下波动性较小，尤其是在进样流速为0.67～0.80 mL/min，进样时间在3～3.5 min 时，29N2/28N2的精密度(以变异系数表示) 可以控制在0.1% 以内，0.93 mL/min 以上的进样流速，29N2/28N2的精密度较差，这可能与进样蠕动泵本身的波动有关。而对于30N2/28N2，整体上其波动性要高于29N2/28N2，进样时间在3 min 以上，进样流速在0.80～0.93 mL/min 时，30N2/28N2的精密度可以控制在1%以内(图3)。30N2/28N2精密度与文献报道的结果比较一致[26]，这可能与30N2容易受到14N16O 的干扰有关，尽管通过增加铜还原炉可以降低14N16O 对30N2的干扰，但并不能消除；此外，30N2/28N2的波动性还可能与四极杆质谱中离子源的使用年限有关，这在以往的研究中有所报道[26]，本实验所采用的离子源已经使用了2 年之久，长时间的走航测试可能使得离子源在电离气体分子时出现一些波动，如果采用新的离子源效果可能会有所改善。综上，在本实验系统下所选用的进样流速为0.80 mL/min，进样时间为3 min 时，29N2/28N2和30N2/28N2的精密度分别可以控制在0.1%和1%以内。

3.2 温度对测试性能的影响

这里我们以N2的信号值和N2/Ar 比值的变异系数为指标来探讨进样温度对测试性能的影响(图4)。进样温度为10℃时，N2的信号值表现最低，15℃时开始升高，之后到30℃略有降低，35℃时又略微升高。在20℃以上，N2信号值总体的波动在正负1%以内，差别不大。而对于N2/Ar 的精密度来说，在20～25℃时变异系数最小，可达0.05%以下，而在15℃以下和30℃以上波动性略大。这样，我们可以选择20～25℃的恒温水浴进行进样以保证测试比值最优的精密度。温度对于N2信号值的影响可以从两个方面进行解释：一是温度对水中溶解气体透过半透膜扩散性能的影响；二是温度对气体溶解度的影响。二者的影响作用是相反的，对于前者，温度越高越有利于气体的扩散，而对于后者，温度越高，气体在水中的溶解度越小。这样在较低的温度下尽管气体的溶解度较大，但是扩散的影响可能占据主导地位导致N2信号响应值较低，而在中间温度，二者的影响相互抵消，使得20～30℃之间N2信号响应值变化不大，而温度进一步升高，尽管气体的溶解度较低，但温度的升高又导致扩散性能的提高使得透过硅胶半透膜的N2量增加，仪器所检测到的N2信号有所升高。

图 2 蠕动泵进样流速与进样时间对28N2 信号值的影响Fig. 2 Effect of peristaltic pump flow speed and injection time on the 28N2 signal value

图 3 蠕动泵进样流速和进样时间对29N2/28N2 和30N2/28N2 的影响Fig. 3 Effect of peristaltic pump flow speed and injection time on 29N2/28N2 and 30N2/28N2

3.3 氧气对测试的影响

氧气对氮气同位素测试的影响如图5 所示。随着铜还原炉从室温(25℃)逐渐升高至200℃，氧气被快速的除去，在300℃以上，氧气的去除效率达到并保持在99.9%以上，说明利用铜还原炉加热的方式可以有效地去除进样气体中的氧气，这与以往文献报道一致[27]。对于氮气的3 种同位素来说，铜还原炉从室温到800℃，28N2信号值基本保持不变，其波动仅为0.6%；29N2信号值从室温到600℃基本保持不变(变异系数CV=0.6%)，而在700℃以上，29N2信号表现出略微的上升趋势；30N2信号值随着铜还原炉温度的升高，表现出逐渐下降的趋势，至300℃，30N2信号值降低至室温值的70%，至600℃，基本保持在70%左右，这说明氧气的去除有效地降低了离子源内因14N16O(质量数30)形成而对30N2检测产生的干扰(ANOVA, P＜0.05)。600℃以上，30N2信号值急剧升高，这可能是由于在高温下原来与Cu 反应生成的CuO 发生少量分解，产生的氧气在离子源内与N 结合生成NO 之故，因此采用铜还原炉的最佳温度在本系统以300～600℃为佳。有报道指出，不同的四极杆质谱的离子源构成对于O2干扰响应的程度也不一样[22,27–28]，对于新组装或新购置的膜进样质谱如果用于15N 标记的29N2和30N2的测量，我们建议进行氧气干扰实验以便确定合适的铜还原炉的使用温度。

3.4 石老人沙滩沉积物异化硝酸盐还原过程

4 结论

图 4 不同进样温度下N2 的信号值和N2/Ar 的变异系数Fig. 4 Signal value of N2 and coefficient of variation of N2/Ar at different temperatures

图 5 铜还原炉温度对于氧气移除效率和N2 同位素测定信号的影响Fig. 5 Effect of copper reduction furnace temperature on the oxygen removal efficiency and the signal of nitrogen isotope

本研究自行组装了膜进样质谱系统，并测试优化了该系统的工作条件，利用该系统结合15N 标记技术测定了青岛石老人沙滩沉积物的异化硝酸盐还原过程，得到的认识如下：

(1)利用自组装的膜进样质谱系统可以用来测定15N 标记的29N2和30N2，在常温下进样即可，所需进样时间较短，测量29N2/28N2和30N2/28N2的精密度分别可以控制在0.1%和1%以内，仅需2 mL 左右的样品即可实现一次测量，非常适合15N 标记的小体积样品的测量。

(2)水样中溶解的氧气对于30N2信号的测量有显著影响(ANOVA, P＜0.05)，采用加热的铜还原炉可以有效的降低氧气的影响，对于铜还原炉的最佳温度可以通过实验进行确定，本组装系统以300～600℃为佳。

(3)对于石老人沙滩沉积物来说同时存在着厌氧反硝化、厌氧铵氧化和DNRA，而不存在将硝酸盐完全还原为氮气好氧的反硝化。厌氧铵氧化、厌氧反硝化和DNRA 的潜在速率(以湿沉积物N 计)分别为(0.05±0.01) nmol/(cm3·h)，(2.32±0.21) nmol/(cm3·h)和(1.02±0.15) nmol/(cm3·h) 。厌氧反硝化是异化硝酸盐还原的主要过程，其贡献比高达近70%，其次是DNRA，贡献约30%，而厌氧铵氧化的贡献不足1%；在N2移除过程中，厌氧反硝化是主要的控制过程，贡献高达98%，厌氧铵氧化的贡献仅为2%。

图 7 有氧条件下石老人沙滩沉积物添加 培养体系中DO、29N2 和30N2 的变化Fig. 7 Changes of DO, 29N2 and 30N2 in culture system of sediment in Shilaoren Beach under aerobic conditions

致谢：感谢海洋化学理论与工程技术教育部重点实验室张海龙高级实验师和宁晓燕实验师在组装膜进样质谱系统管路选材方面给予的帮助和建议。感谢郑文静和秦川同学在四极杆质谱仪使用方面给予的帮助。