基于网络药理学克银丸治疗银屑病作用机制的研究

申倩，张婷，熊万涛，李俊辰，张宇

（1.天津中医药大学，天津300073；2.天津市中医药研究院附属医院，天津300120）

银屑病是一种遗传与环境共同作用诱发的免疫介导的慢性、复发性、炎症性、系统性疾病，典型临床表现为局限或广泛分布的鳞屑性红斑或斑块。银屑病的分型主要包括寻常型、脓疱型、红皮病型及关节病型银屑病和银屑病共病[1]，其中以寻常型最常见，占全部患者的97%以上，中医称银屑病为“白疕”，根据辨证将寻常型银屑病分为血热证、血虚证、血瘀证，分别与西医的进行期、静止期、退行期相对应。

克银丸处方来源于中国中医科学院广安门医院朱仁康大夫，于上世纪90年代由北京中药五厂研制，北京同仁堂药业有限公司现为其原发企业，该药以土茯苓、拳参、白鲜皮、北豆根4味中药组成，有清热解毒、祛风止痒的功效，主治血热风燥型银屑病，经过340多例银屑病患者的临床试验，患者服用克银丸后有效率在94%以上[2]，近5年的国内银屑病相关诊疗指南、专家共识均将克银丸列为治疗血热证银屑病的推荐中成药[1，3]。

中药复方优势在于系统调控和协同作用，使其可以治疗多因素复杂性疾病，但这也导致中药复方从整体到分子水平研究的困难。网络药理学可以通过“关系→网络→功能”分析中药复方多靶点整合调节的作用机制，以及方证相应和病证对应的整体特性的研究思路[4]。因此，利用网络药理学对中药复方治疗疾病的机制进行研究，能够明确药物的活性成分，并将药物的作用机制深入到分子生物学层面。本研究运用网络药理学探讨克银丸对银屑病的多成分、多靶点治疗，旨在为揭示克银丸作用机制的科学内涵提供参考。

1 方法

1.1 克银丸化合物及作用靶点的筛选 釆用TCMSP（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php），以土茯苓、拳参、白鲜皮、北豆根为关键词，口服生物利用度（OB）≥30%且类药性（DL）≥0.2为标准，收集并筛选出克银丸的全部化合物及其作用靶点。

1.2 疾病靶点的确定利用OMIM（https：//omim.org/）、Genecards（https：//www.genecards.org/）、PharmGkb（https：//www.pharmgkb.org/）以及TTD（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）疾病数据库，以银屑病为关键词，高相关性为标准，筛选汇总疾病的高关联度靶点。

1.3 疾病-化合物共同靶点的筛选 利用VennPainter软件，将克银丸化合物的作用靶点与疾病靶点取交集，筛选出二者共同的作用靶点。

1.4 药物-共同靶点-疾病网络的构建 将克银丸中的化合物、银屑病以及二者的共同靶点蛋白上传至Cytoscape软件（http：//www.cytoscape.org/）生成体现药物-共同靶点-疾病相互作用的网络图，以探究克银丸的药理学作用机制。

1.5 PPI网络的构建 利用String（https：//stringdb.org/）蛋白互作数据库和Cytoscape软件分析共同靶点蛋白之间的相互作用，并用R语言进行计数分析。

1.6 GO功能富集分析 利用Cytoscape软件对共同靶点蛋白进行GO功能富集分析，以了解共同靶点蛋白在基因功能中的作用，通过Omicshare软件（http：//www.omicshare.com/tools/index，php/）对结果进行可视化处理。

1.7 KEGG通路富集分析 利用David（https：//david.ncifcrf.gov/）数据库和Cytoscape软件将共同靶点进行KEGG通路富集分析，对共同靶点蛋白在信号通路中的作用做注释分析，得到克银丸治疗银屑病的信号通路，通过Omicshare软件对结果进行可视化处理。

2 结果

2.1 克银丸化合物及作用靶点的筛选 利用TCMSP分别查找克银丸中四味中药的化合物及作用靶点，经过整理，克银丸活性化合物共有42种，其中白鲜皮14种、拳参6种、土茯苓15种、北豆根10种（白鲜皮、拳参、土茯苓都含有槲皮素和β-谷甾醇），见表1。查找克银丸中化合物的靶点，通过筛选，共有73个化合物作用靶点。

2.2 疾病靶点及药物-疾病共同靶点的确定 利用OMIM、Genecard、PharmGkb以及TTD疾病数据库，筛选出1 081个疾病靶点。结合73个化合物的靶点，利用VennPainter软件，分析得出克银丸与银屑病的共同靶点有46个。

2.3 药物-共同靶点-疾病网络的构建与分析 利用Cytoscape软件构建药物-共同靶点-疾病的网络图，见图1。图中共有77个节点，包括1个银屑病节点（红色）、4个中药节点（蓝色）、26个化合物节点（绿色）、46个共同靶点的节点（橙色）。克银丸所有化合物中有16个化合物与药物-疾病共同靶点没有联系，未参与网络的构建。在26种化合物中，包括土茯苓的10种化合物、白鲜皮的7种化合物、拳参的4种化合物、北豆根的9种化合物，其中白鲜皮、土茯苓和拳参共同包含的化合物是槲皮素和β-谷甾醇，说明这2种化合物在克银丸药物组成中占到重要地位，而北豆根的9种化合物均是其独有的，与其他3味中药没有重合。调控的靶点数目排前5位的化合物是槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、汉黄芩素、柚皮素，说明这些化合物在克银丸治疗银屑病中起主要作用。化合物调控的靶点数目前3位是环加氧酶（PTGS）1、核因子（NF-κB）3、CASP3，是克银丸治疗银屑病的主要靶点。

表1 克银丸中42个候选化合物的基本信息

图1 药物-共同靶点-疾病网络

2.4 PPI网络的构建与分析 利用String蛋白互作数据库和Cytoscape软件分析共同靶点蛋白之间的相互关系，见图2。PPI计数排名前5位的靶点是白细胞介素（IL）-6、血管内皮生长因子（VEGF）A、表皮生长因子受体（EGFR）、CASP3、CCND1，相互关系计数越多，说明该靶点在克银丸治疗银屑病中起更为重要的作用，见图3。

2.5 GO功能富集分析 对克银丸化合物和银屑病的共同靶点进行GO功能富集分析，以错误发现率（Falsediscoveryrate，FDR）＜0.05为标准，确认了658条结果，利用Omicshare软件对结果进行可视化处理，展示前20个共同的基因功能，见图4。排名前5位的分别是对氧水平的反应、对低氧的反应、对抗生素的反应、对氧含量下降的反应以及对氧化应激的反应。

图2 PPI网络

图3 PPI计数

图4 GO功能富集

2.6 KEGG通路富集分析 对克银丸化合物与银屑病的共同靶点利用DAVID数据库进行KEGG通路富集分析，以P＜0.01，FDR＜0.05进行筛选，并将结果利用Omicshare软件可视化，见图5。信号通路主要包括肿瘤MicroRNAs通路、PI3K-Akt信号通路、癌症蛋白多糖通路、流体剪切损伤和动脉粥样硬化通路、卡波西肉瘤相关的疱疹病毒感染通路、人巨细胞病毒感染通路、MAPK信号通路、在糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、乙型肝炎通路、肝细胞癌通路、EB病毒感染通路、大肠癌通路、前列腺癌通路、TNF信号通路、黏附斑激酶信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药通路、HIF-1信号通路、松弛素信号通路、麻疹通路、膀胱癌通路。

3 讨论

中药有多靶点、多途径调节的特点，虽然提高了临床疗效，但也给实验研究带来了很多困难。网络药理学是一门运用网络分析药物与疾病靶点之间“多成分、多靶点、多途径”协同作用关系的药理学分支学科[4]。利用网络药理学，可以弥补以往中药研究单一靶点的不足，提高实验研究的成功率。目前，银屑病的确切病因与发病机制尚未完全阐明，普遍认为是遗传背景、环境诱因、免疫应答异常等因素相互作用，最终导致角质形成细胞异常增殖和/或关节滑膜细胞与软骨细胞的炎性反应[5]。中医认为伏邪于络为银屑病发病的基础：伏邪主要指先天、外感、内生、转化等邪气。银屑病未发时伏邪藏匿于脉络，随着伏邪不断积聚或正气的变化，正邪相对平衡被打破，正气无力对抗和抑制伏邪，伏邪乘势而发，从而导致银屑病[6]。克银丸由土茯苓、拳参、白鲜皮、北豆根4味中药组成，有清热解毒，祛风止痒的功效，对于血虚风燥型银屑病疗效明显。本文旨在利用网络药理学，预测克银丸治疗银屑病的作用机制，为临床应用和实验研究提供参考。

图5 KEGG通路富集分析

本研究以药物-共同靶点-疾病网络筛选共得到克银丸作用于银屑病的26个核心成分化合物，对应42个核心调控靶点。其中最关键成分化合物包括槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、汉黄芩素、柚皮素。槲皮素是白鲜皮、拳参、土茯苓共同的有效成分，且调控的疾病靶点最多。研究者发现槲皮素能够通过NF-κB途径降低银屑病皮损面积及严重程度指数（PASI）评分和银屑病样病变的温度，改善组织恶化程度，降低血清中肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-6和IL-17，诱导小鼠皮肤组织中谷胱甘肽、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性增加，丙二醛积累减少，而改善咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮肤炎性反应[7]。β-谷甾醇同是白鲜皮、拳参、土茯苓3味中药共同的有效成分，且调控的疾病靶点数量仅次于槲皮素，β-谷甾醇能够抑制炎性反应，减少TNF、IL-1β和IL-6的释放，改善银屑样特征性皮损[8]。木犀草素是白鲜皮的有效成分之一，Zuyi等[9]研究发现，木犀草素可降低角质形成细胞和正常人表皮角质形成细胞IL-6、IL-8和VEGF的生成，抑制TNF触发的NF-κB相关通路的激活以及NF-κB1和NF-κB3的表达，并且能够在不影响细胞内三磷酸腺苷含量的情况下减少角质细胞增殖。T淋巴细胞释放的细胞因子能够作用于角质形成细胞和血管内皮细胞[10]，而使皮肤呈红斑鳞屑症状，这可能是银屑病发病的一个重要因素[11]。白鲜皮中的汉黄芩素能够通过抑制JurkatT细胞CD69的表达，抑制T细胞的活化来治疗银屑病[12]。柚皮素是土茯苓的活性成分，研究发现柚皮素负载丝胶蛋白微粒有TNF-α阻断剂作用，可用来治疗中期银屑病[13]。有趣的是，北豆根中的蝙蝠葛碱、青藤碱、北豆根碱被明确可造成肝肾损伤，主要机制与过氧化损伤路径有关[14]，且最新研究显示北豆根中含有马兜铃酸类物质[15]，马兜铃酸是公认的可造成肝肾损伤的物质[16-17]，而本研究发现蝙蝠葛碱、北豆根碱与马兜铃酸类均不属于克银丸治疗银屑病的核心成分，因此，在克银丸生产过程中去除非本研究筛选出的核心处分，在一定程度上可以降低克银丸的不良反应。

药物-共同靶点-疾病网络显示，PTGS1是被药物调控最多的作用靶点，NF-κB3和CASP3次之。PTGS1又叫做环氧合酶（COX）-1，有研究表明PTGS1在银屑病血管异常生成中起到重要作用，与银屑病局部皮肤炎性反应密切相关[18-19]。NF-κB3是NF-κB一种亚型，在银屑病皮肤炎性反应损伤中发挥了关键作用，有研究表明，NF-κB3在银屑病皮肤组织中表达异常升高，使用木犀草素能够抑制NF-κB3的表达来缓解银屑病[9，20]。CASP3是一种凋亡标记物，研究发现银屑病角质形成细胞通过下调CASP3活性上调相关miRNAs表达来抵抗凋亡，增加CASP3蛋白表达可能起到有效治疗银屑病的作用[21-22]。

利用共同靶点构建PPI网络，分析得出克银丸治疗银屑病的关键靶点包括IL-6、VEGFA、EGFR、CASP3、CCND1等。对共同靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，进一步明确共同靶点在基因功能和信号通路中的作用。GO功能富集分析显示共同靶点的基因功能主要集中在氧感知相关通路，这与角质形成细胞异常增殖是银屑病的发病机制相符，说明角质形成细胞对氧的需求变化是疾病发展的关键改变，为明确具体的信号通路，在KEGG信号通路分析中发现，共同靶点的作用通路中MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路等都与HIF-1信号通路密切相关。研究发现氧化应激标志物如抗氧化酶过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、丙二醛等与银屑病的严重程度和进展密切相关，而导致氧化应激主要原因是活性氧的增加，活性氧增加会刺激MAPK炎性信号通路增加促炎性介质和VEGF的释放，进而加重银屑病皮肤损伤[23]。表皮细胞增殖主要靠PI3K-AKT信号通路调节，PI3K/AKT信号通路通过磷酸化和抑制下游关键靶点FOXO转录因子来促进细胞存活，并通过灭活细胞周期抑制剂和促进细胞周期蛋白来影响细胞增殖[24]，有研究表明PI3K/AKT信号通路主导表皮细胞的存活和分化，调控表皮细胞的最终分化程序[25]。缺氧诱导因子（HIF）-1由HIF-1α和HIF-1β2个亚单位组成，在银屑病发病过程中角质形成细胞异常增殖，局部皮肤组织过度缺氧，而为细胞生存提供必要的氧气，HIF-1α表达增加促使VEGF及其相关受体表达上调，进而促进血管生长，恶性循环使银屑病进一步加重。已有研究证实银屑病患者皮肤组织中HIF-1表达增加[26]，HIF-1α能通过调控VEGF、COX-2、诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）、基质金属蛋白酶（MMP）-2、葡萄糖转运蛋白（GLUT）、骨形态发生蛋白（hBMP）6等多种下游因子引起真皮乳头层微血管增生和表皮角质层过度增殖，致使银屑病发生[27]。

银屑病的病理特征包括角质形成细胞异常增殖和/或关节滑膜细胞与软骨细胞的炎性反应，以及微血管的异常新生。其中角质形成细胞的异常增殖，会导致表皮对氧的需求增加。银屑病患者与正常人相比，表皮组织的HIF-1α表达显著增加[26]。同时，HIF-1α也能通过刺激VEGF促进血管的生成。富马酸酯临床上用于治疗中重度的银屑病，其主要成分二甲基甲酰胺能通过促进HIF-1α的降解而削弱其蛋白表达[28]，进一步抑制VEGF和氧感知通路，抑制血管的生成和角质形成细胞的供氧，从而达到治疗银屑病的目的。

综上所述，本研究基于网络药理学分析，探讨了克银丸对银屑病的多成分、多靶点治疗途径，明确了克银丸的核心药物成分组成，也借鉴中医以方论证的方法，通过克银丸推导银屑病的发病机制，得出克银丸治疗银屑病的机制与HIF-1信号通路以及氧感知相关通路有紧密联系，为后续进一步提高克银丸的安全性、有效性提供了科学依据，推动了中医药现代化的研究发展。