鞑靼忍冬和疏花蔷薇组培快繁体系的建立研究

(1.新疆农业大学 林学与园艺学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.新疆特克斯县林业局，新疆 特克斯县 835500)

鞑靼忍冬(LoniceratataricaL.)别名新疆忍冬、桃色忍冬，为忍冬科忍冬属落叶灌木，在新疆主要分布于西天山海拔1 100～1 800 m的山谷、沟谷、河谷及河岸边[1]。疏花蔷薇(RosalaxaRatz.)是蔷薇科、蔷薇属的落叶灌木，在新疆主要分布于西天山海拔500～1 150 m的山谷、沟谷、河谷及河岸边[2]。鞑靼忍冬和疏花蔷薇作为西天山野果林中极具特色的伴生种，具有较高的抗逆性和观赏价值。新疆地处西北干旱区，由于环境条件相对恶劣，导致城市绿地生态系统种类相对单一、结构简单、稳定性差，缺乏地域特色等现象[3]。因此，研究和开发利用野生观赏植物资源，对于丰富新疆园林绿化植物种类、提高植物抗性、培育新品种、塑造具有地方特色的园林景观具有重要的意义。在实际生产中，鞑靼忍冬和疏花蔷薇多采用种子和扦插繁殖方法进行繁殖，扦插虽能够快速体现出观赏植物的观赏价值，但长期采用扦插繁殖易致种质退化，且种子繁殖困难，相对比较植物组织培养技术具有繁殖速度快、取材少、保持母株优良遗传特性等优点，更适合于优良树种的大量繁殖[4]。李翔等通过研究华南忍冬组织培养的无菌体系建立发现，初代培养腋芽萌发较适宜的培养基为MS+6-BA 2.0 mg·L-1,萌发率为63.3%；继代增殖较适宜培养基为MS+6-BA 1.7 mg·L-1，平均每丛丛芽增加芽数为10.7个[5]；叶立涛等研究灰毡毛忍冬组织培养与快繁技术，结果发现：最适初代培养基为 N 6+1.0 mg·L-1BA+0.1 mg·L-1NAA；最佳增殖培养基为N 6+1.5 mg·L-1BA+ 0.5 mg·L-1NAA，增殖系数高达 5.2；最佳生根培养基为 1/2 MS+1.5 mg·L-1IBA+ 1%活性炭最好[6]；李斌认为,培养基1/2 MS+0.50 mg·L-1TDZ+0.02 mg·L-12,4-D+5.0 mg·L-1AgNO3适用于无籽刺梨叶柄的分化培养，分化率为 50.0%；适用于无籽刺梨增殖的培养基为MS+0.50 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-1NAA，增殖倍数达5.56；在1/2 MS+0.10 mg·L-1IBA+0.20 mg·L-1NAA+0.30 g·L-1活性炭的培养基上，无籽刺梨的生根率为 92.5%[7]。以天山野果林鞑靼忍冬和疏花蔷薇带芽茎段为试验材料，采用不同培养基、不同植物生长调节剂处理方法进行组织培养试验，期望为鞑靼忍冬和疏花蔷薇的引种、繁殖及育种工作提供技术支持和科学依据。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

以鞑靼忍冬和疏花蔷薇具有腋芽的茎段为材料，材料为种植于新疆农业大学林学与园艺学院实验室的一年生幼苗。

1.2 试验方法

1.2.1外植体的消毒

将枝条截成2～3 cm长带1～2个节的茎段，用饱和洗衣粉溶液浸泡30 min，然后用自来水冲洗干净，并用流水冲洗2 h左右。然后在超净工作台上，用75%酒精浸泡20 s，1 g·L-1升汞溶液消毒5 min，再用无菌水冲洗5次，期间不断摇动，然后将茎段取出置于接种盘中备用。

1.2.2诱导培养

选择MS和B5培养基为基本培养基，同一附加1.5 mg·L-16-BA和0.5 mg·L-1IBA；在超净工作台上，将已消毒的外植体材料剪去两端已被消毒剂损伤的组织，留取长1.5～2.0 cm的茎尖或具腋芽的节间，接种于已准备好的基本培养基上，每瓶培养基接3个外植体材料，每种培养基20瓶，重复3次。培养30 d后统计污染率和腋芽诱导率。所有培养基的蔗糖浓度均为30 g·L-1，琼脂浓度均为7 g·L-1，pH=5.8。培养温度(24±2)℃，光照强度1 500～2 000 lx，光照时间12 h·d-1。

腋芽诱导率(%)=(萌芽的外植体数/接种外植体总数)×100%；

污染率(%)=(污染的外植体数/接种的外植体总数)×100%。

1.2.3增殖培养

将外植体诱导所得丛生芽进行剪切，以2～4个芽为一丛进行分割后，接种到增殖培养基上培养，MS培养基为基本培养基，附加6-BA( 1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1、2.0 mg·L-1)、NAA(0.2 mg·L-1、0.5 mg·L-1) 和GA3(0 mg·L-1、1.0 mg·L-1)，总12个处理；每种培养基接种7瓶，每瓶3株，30 d后统计不定芽的增殖情况，计算增殖系数。所有培养基的蔗糖浓度均为30 g·L-1，琼脂浓度均为7 g·L-1，pH=5.8。培养温度(24 ± 2)℃，光照强度1 500～2 000 lx，光照时间12 h·d-1。

增殖系数=总芽数/接种芽数。

1.2.4生根培养

将株高2 cm以上、带有4个以上叶片的无根壮苗，转接到生根培养基上，1/2 MS培养基为基本培养基，附加NAA(0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1)、6-BA(0.05 mg·L-1、0.1 mg·L-1) 和AC(0 g·L-1、1.0 g·L-1)，总12个处理；每种培养基接种7瓶，每瓶3株，进行生根培养，20 d观察统计生根率。所有培养基的蔗糖浓度均为30 g·L-1，琼脂浓度均为7 g·L-1，pH=5.8。培养温度(24 ± 2)℃，光照强度1 500～2 000 lx，光照时间12 h·d-1。

表2 不同激素配比对鞑靼忍冬和疏花蔷薇增殖培养的影响

注:同列数据后标有不同小写字母分别表示差异极显著(p<0.5)。

生根率(%)=(生根苗数/接种苗数)× 100%。

1.2.5移栽炼苗

生根培养20 d后,打开瓶口,使生根苗逐渐与外界接触,以提高其适应能力。保持较高的空气湿度,气温高时注意遮阴,炼苗5 d。取苗前24～36 h,培养瓶注入干净的自来水,以不淹没小苗为标准。取苗时,将注水软化的培养基直接倾倒至塑料盆中,拾取小苗,洗净根部的培养基,用1%的高锰酸钾溶液浸泡小苗5～10 min,然后分别移入珍珠岩、珍珠岩+蛭石(1∶1)、珍珠岩+园土(1∶1)和蛭石+园土(1∶1)的基质中,置于相对湿度80%～90%、温度35～30 ℃的塑料拱棚培养，移栽30 d后统计成活率。

1.3 数据分析

采用Excel 2010软件和SPSS 17.0软件进行方差分析和显著性分析。

2 结果与分析

2.1 诱导培养

由表1可以看出，MS培养基中的鞑靼忍冬和疏花蔷薇腋芽诱导率高于B5培养基。MS培养基上的鞑靼忍冬和疏花蔷薇腋芽诱导率分别为99.12%和100%，而B5培养基上的鞑靼忍冬和疏花蔷薇腋芽诱导率分别为96.43%和94.74%。而且MS培养基中的外植体愈伤组织多、丛生芽粗壮、生长快；MS培养基中的鞑靼忍冬和疏花蔷薇、B5培养基中的鞑靼忍冬和疏花蔷薇污染率分别为0、0、0和5%。由此可见，鞑靼忍冬和疏花蔷薇茎段适宜的诱导培养基为MS培养基。

2.2 增殖培养

生长调节剂6-BA、NAA和GA3的不同浓度组合对鞑靼忍冬和疏花蔷薇的增殖影响不同。由表2可知，其他因素不变的情况下，鞑靼忍冬和疏花蔷薇增殖系数随着NAA浓度的增加逐渐降低。随着6-BA浓度的增加鞑靼忍冬的增殖系数逐渐提高，而疏花蔷薇的增殖系数随着6-BA浓度的增加而降低；添加GA3处理的增殖系数高于没有添加GA3处理。培养基MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+GA31.0 mg·L-1上的鞑靼忍冬丛生芽增殖数最多，增殖系数高达5.37，为鞑靼忍冬最佳的继代增殖培养基。而疏花蔷薇增殖数最多的是MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+GA31.0 mg·L-1培养基，增殖系数为3.0。

表1 不同培养基对鞑靼忍冬和疏花蔷薇诱导率的影响

2.3 生根培养

2.3.1不同激素处理对鞑靼忍冬和疏花蔷薇生根率的影响

将经过增殖培养30 d后，株高达2 cm以上的健壮鞑靼忍冬和疏花蔷薇组培苗植株转接入含有不同浓度植物生长调节剂的1/2 MS培养基中进行生根培养。由表3可知，3种激素对鞑靼忍冬和疏花蔷薇组培苗生根的影响程度不同。在其他因素不变的情况下，鞑靼忍冬组培苗生根率随着NAA浓度的提高先降后升，而随着6-BA浓度的增加而降低；添加活性炭的培养基中，鞑靼忍冬组培苗生根率明显高于没有活性炭的组培苗。疏花蔷薇组培苗生根率随着NAA和6-BA浓度的增加而提高；活性炭对疏花蔷薇的影响与鞑靼忍冬相似。因此，适合鞑靼忍冬组培苗生根的最佳培养基为1/2 MS+NAA 1.5 mg·L-1+6-BA 0.05 mg·L-1+ 活性炭1.0 g·L-1，生根率为100%；而疏花蔷薇组培苗生根最佳的培养基为1/2 MS+NAA 1.5 mg·L-1+6-BA 0.1 mg·L-1+ 活性炭1.0 g·L-1，生根率为66.67%。

表3 不同激素处理对鞑靼忍冬和疏花蔷薇生根率的影响

注:同列数据后标有不同小写字母分别表示差异极显著(p<0.5)。

注：A为不同激素处理对平均根数量的影响；B为不同激素处理对平均根长度的影响；C为不同激素处理对平均根粗度的影响。图1 不同激素处理对鞑靼忍冬和疏花蔷薇组培苗根质量的影响

2.3.2不同激素处理对鞑靼忍冬和疏花蔷薇不定根质量的影响

从图1可以看出，各处理对鞑靼忍冬和疏花蔷薇组培苗不定根质量影响的变化趋势规律性不明显。平均根数量方面，鞑靼忍冬在培养基1/2 MS+NAA 1.0 mg·L-1+6-BA 0.1 mg·L-1+活性炭1.0 g·L-1中达到最高点，平均根数量为7.5条；而疏花蔷薇的最高根数量出现在培养基1/2 MS+NAA 1.5 mg·L-1+ 6-BA 0.1 mg·L-1+活性炭1.0 g·L-1中，平均根数量为4.5条；在平均根长度方面，鞑靼忍冬和疏花蔷薇都在培养基1/2 MS+NAA 1.0 mg·L-1+ 6-BA 0.05 mg·L-1+活性炭1.0 g·L-1中达到最高平均根长度，分别为39.5 mm和29.1 mm；而平均根粗度方面，鞑靼忍冬和疏花蔷薇都在培养基1/2 MS+NAA 1.5 mg·L-1+6-BA 0.1 mg·L-1+活性炭1.0 g·L-1中达到最高的平均根粗度，分别为0.74 mm和1.01 mm。

2.4 移栽练苗

将生根的鞑靼忍冬和疏花蔷薇组培苗在湿度为80%～90%的环境中炼苗5 d后，用镊子取出，用自来水冲洗干净根系，然后移栽至4种基质中(表4)，每种基质20株，1个月后统计成活率。由表4可知，移栽珍珠岩中的鞑靼忍冬和疏花蔷薇组培苗成活率均高于其他3种基质，成活率分别为90.00%和75.00%；而蛭石+园土(体积比1∶1)基质中组培苗的成活率最低，鞑靼忍冬和疏花蔷薇成活率为20.00%和25.00%；4种基质中鞑靼忍冬和疏花蔷薇组培苗最佳移栽基质为单独的珍珠岩。

表4 不同基质处理对鞑靼忍冬和疏花蔷薇移栽苗成活率的影响

3 讨 论

3.1 基本培养基对不定芽诱导的影响

MS和B5是在木本植物组织培养中最常用的培养基。由于各种植物所需营养成分不尽相同，因此不同植物材料所适宜的诱导分化培养基也不同[8]。因此，选择适合的基本培养基对植物组织培养的成败至关重要。本试验得出，鞑靼忍冬和疏花蔷薇组织培养所适宜的基本培养基是MS培养基，接种MS培养基上的鞑靼忍冬和疏花蔷薇不定芽诱导率比B5培养基上的鞑靼忍冬和疏花蔷薇高2.69%和5.26%。张启昌等用MS、N6、B5、H 和 White 5种培养基进行了对比试验，发现MS是蓝靛果忍冬茎段最佳的诱导培养基，分化率达到 98.5%[9]。赵松峰发现，在MS、B5、White、WPM 4种基本培养基中，MS培养基是诱导丰花月季叶片愈伤组织的最佳培养，诱导率为35.5%[10]。刘冠楠等发现，MS培养基对金樱子茎段不定芽诱导的效果均优于WPM和B5两种培养基[11]。鞑靼忍冬和蓝靛果忍冬属于忍冬属，疏花蔷薇、丰花月季和金樱子属于蔷薇属，因此认为MS培养基比B5培养基更有利于忍冬属和蔷薇属植物不定芽的诱导，这可能是MS培养基具高盐成分且所含微量元素和有机成分齐全而丰富，能较好地满足忍冬属和蔷薇属植物对营养的需求。

注：A为鞑靼忍冬腋芽诱导培养；B为鞑靼忍冬组培苗增殖培养：C为鞑靼忍冬组培苗生根培养；D为鞑靼忍冬组培苗移栽。图2 鞑靼忍冬组培苗生根过程

注：A为疏花蔷薇腋芽诱导培养；B为疏花蔷薇组培苗增殖培养：C为疏花蔷薇组培苗生根培养；D为疏花蔷薇组培苗移栽。图3 疏花蔷薇组培苗生根过程

3.2 不同植物生长调节剂对腋芽增殖的影响

继代增殖是组织培养的关键，细胞分裂素6-BA与生长素NAA 的配比对组培苗增殖的影响较大[12]。因此，在鞑靼忍冬和疏花蔷薇腋芽继代增殖培养中设计了6-BA、NAA和GA3的组合配方。本试验发现，鞑靼忍冬增殖培养基中6-BA与NAA比例为10∶1，附加1.0 mg·L-1GA3时增殖率最高，增殖系数为5.73。李群等研究认为，6-BA与NAA比例为3∶1有利于灰毡毛忍冬新品种‘渝蕾一号’腋芽的增殖，增殖系数为5.1[13]；李永兴等研究发现，6-BA与NAA比例为30∶1时，不仅灰毡毛忍冬苗生长旺盛，而且具有较高的增殖系数，增殖倍数达4倍以上[14]；分析认为，虽然鞑靼忍冬和灰毡毛忍冬都属于忍冬属，但腋芽增殖培养所需要的6-BA和NAA比例不尽一致，这可能是由于生长环境和基因型差异所导致的。因为鞑靼忍冬是野生忍冬，主要分布在西天山野果林，而灰毡毛忍冬是栽培品种，受到常年生长环境的影响，导致虽然同属于忍冬属植物，但是对生长调节剂的需求差异很大。

3.3 活性炭对组培苗生根的影响

组织培养过程中，组培苗的生根好坏将直接影响到组培苗的质量和移栽成活率，活性碳对组培苗生根具有重要影响。活性炭由于具有极高的吸附能力已被广泛用于植物组织培养中,它还能将培养基变黑提供类似土壤的暗化条件,有利于离体生根与根生长[15]；本试验中发现，鞑靼忍冬和疏花蔷薇组培苗分别在生根培养基1/2 MS+NAA 1.5 mg·L-1+6-BA 0.05 mg·L-1和1/2 MS+NAA 1.5 mg·L-1+6-BA 0.1 mg·L-1上同一附加 0.1% 活性炭时生根率最高，生根率分别为100%和66.67%。马丽娜等研究认为，培养基1/2 MS + 0.5 mg·L-1NAA上，添加0.2%活性炭能促进新塔花的生根，生根率达60%，平均生根数达3.5条[16]；金香花等研究发现，1/2 MS+1.0 mg·L-1IBA+0.1% 活性炭是树莓生根和试管苗生长的最佳培养基[17]；王一诺等认为，培养基1/2 MS+NAA 2.0 mg·L-1+ IBA 0.2 mg·L-1上，附加0.1%活性炭对黑果菝葜组培苗生根效果最好，生根率达到70%[18]。因此，生根培养基中添加0.1%～0.2%活性炭有利于组培苗生根，这可能是活性炭能吸附生根培养过程中产生的有害酚类物质,同时它还能将培养基变黑提供类似土壤的暗化条件。

4 结 论

通过研究培养基种类和植物生长调节剂对鞑靼忍冬和疏花蔷薇离体培养及植株再生的影响,发现MS为鞑靼忍冬和疏花蔷薇茎段初代培养最适宜的基本培养基，在培养基MS+6-BA 1.5 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1中,鞑靼忍冬和疏花蔷薇诱导率分别可达99.12%和100%；适合鞑靼忍冬腋芽增殖的培养基为MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+GA31.0 mg·L-1，增殖系数可达5.37；而疏花蔷薇腋芽增殖的最佳培养基为MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1，增殖系数高达3.0；适合鞑靼忍冬组培苗生根的最佳培养基为1/2 MS+NAA 1.5 mg·L-1+6-BA 0.05 mg·L-1+ 活性炭1.0 g·L-1，生根率为100%；而疏花蔷薇组培苗生根最佳的培养基为1/2 MS+NAA 1.5 mg·L-1+6-BA 0.1 mg·L-1+ 活性炭1.0 g·L-1，生根率为66.67%。炼苗移栽到单独的珍珠岩基质中,鞑靼忍冬和疏花蔷薇成活率分别达90%和75%。