油桐花序石蜡切片制作方法改良

付 盼，李文莹，刘美兰，李 静，张 琳

（中南林业科技大学 经济林培育与保护省部共建教育部重点实验室，湖南 长沙 410004）

油桐Vernicia fordii是大戟科Euphorbiaceae 油桐属Vernicia落叶乔木，是我国热带和亚热带特有的木本工业油料树种，在我国湖南、湖北、重庆等省区都有大面积栽培[1-2]。油桐种子榨出来的油称作桐油，桐油是植物油中最优质的干性油[3]。桐油用途广泛，尤其是可作为生产环保型油漆（涂料）的良好原料，同时也是制造生物柴油和高分子材料的优质原料[4-6]。油桐栽培生产上普遍存在着雄花多、雌花少的问题，低雌雄花比例是影响油桐果实产量的重要因素之一。为了研究油桐雌雄花的花芽分化过程及其成花机理，首先需要对其花序的组织形态学进行系统的研究。目前关于油桐的研究主要集中在苗木培育[7-10]、生理特性[11-14]、 病虫害防治[15-17]、化学成分分析[18-20]、基因克隆与表达[21-24]等方面，关于油桐各组织器官的细胞学及形态学研究报道较少。石蜡切片技术作为研究植物内部构造和发育形态的一项重要技术，极大地推动了植物组织形态学的发展。然而，常规石蜡切片技术并不适用于所有的试验材料的研究，譬如油桐、杏花[25]、石榴花[26]以及木本植物的茎段[27]等。

油桐多为雌雄同株异花植物，花序为圆锥状聚伞花序，在花序主轴或二级主轴顶端着生一朵或几朵雌花，而雄花包围在外[28]。雌雄花器官尚未形成前，油桐花序轴也未分化完成，此时花序体积较小，常规的石蜡切片制作较为容易。但当油桐雌雄蕊形成时，其花序结构基本分化完毕，各级轴主次分明，小花体积也逐步增大，此时油桐花序横纵径约为1～1.5 cm，花序中包含着少则20 朵，多则上百朵小花，且小花之间排列紧密，小花萼片内外密披绒毛和黏液，花序轴上着生大量小叶。油桐复杂的花序结构及其分泌物质，使处于此发育时期的油桐花序在石蜡切片制作过程中存在着浸蜡不充分、切片碎裂、染色不均等问题，从而影响切片质量。

针对这些问题，本文以油桐花序为实验材料，拟根据油桐花序材料的特点，探索出适用于油桐花序的改良石蜡切片技术，为研究油桐花芽分化及雌雄花发育的细胞学特征提供良好的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料为三年桐优良家系‘ZNL-F007’，栽植于湖南省永顺县中南林业科技大学油桐试验基地。于2018年7月下旬，选择长势良好，无病虫害的植株，采集新梢顶端约1.5 cm 的新鲜完整的雄花芽(图1A、B)为实验材料。

1.2 常规石蜡切片方法

常规方法参照陈延惠[29]、吴影[30]等的方法进行。将固定好的材料稍剥去苞片后经30%、50%、70%、80%、85%、90%、95%、100% 乙醇进行梯度脱水，每梯度30 min；然后将乙醇与二甲苯按2∶1、1∶1、1∶2 比例混合液、二甲苯2 次，每梯度30 min 透明处理；将二甲苯与石蜡分别按2∶1、1∶1、1∶2 比例配成混合液，60 ℃浸蜡，再于纯石蜡中浸蜡2 次，每次2 h，包埋；随后用轮转式切片机切片，厚度10 μm，展片、烘片；二甲苯脱蜡2 次，每次15 min，1/2 乙醇+1/2 二甲苯15 min，100%乙醇两次，每次5 min，90% 乙醇、80% 乙醇、70% 乙醇，各梯度5 min，1%番红染色70 min、0.5%固绿 6 s、70%、80%、90%、95%乙醇，每梯度5 min、100%乙醇2 次，每次3 min、1/2 乙醇+1/2 二甲苯5 min、二甲苯2 次，每次15 min；中性树胶封片。

1.3 改良石蜡切片方法

1.3.1 固定与处理

将新鲜材料剥去外部苞片后投入FAA（70%乙醇∶冰醋酸∶甲醛=9∶0.5∶0.5）固定液中，抽气处理30 min，待固定24 h 以上，换70%乙醇4 ℃保存。样品脱水处理前，在体式显微镜下切除花芽基部多余组织，剥去花序四周残余苞片，并拆除花序基序轴上多余分支，只留花序主轴及其两侧相互对称的两个分支，用小毛刷轻轻刷除花序外围的绒毛（图1C、D）。

1.3.2 脱水与透明

材料经85%乙醇、95%乙醇脱水处理1 h，100%乙醇脱水处理45 min，重复一次。随后样品转至无水乙醇与二甲苯等体积混合液中静置1 h，然后在足量二甲苯中透明，二甲苯更换2 次，每次30 min。

1.3.3 浸蜡与包埋

将透明完成后的样品转入盛有二甲苯的小坩锅中，加入等体积的石蜡溶液（石蜡的熔点为56～58 ℃）中。将坩锅置于55 ℃烘箱中，恒温保持 2 h 后更换为纯蜡，其后1 d 内更换3 次以上纯蜡，浸蜡期间烘箱保持在60 ℃。包埋时，将提前准备好的塑料包埋盒在60 ℃烘箱中预热3～5 min，将材料置入装有蜡液的包埋盒中摆正好位置，放入60 ℃ 烘箱30 min 后取出，常温冷却（图1E、1F）。

1.3.4 切片与烘片

将包埋后的蜡块进一步修整成规整的四棱台，将蜡块转移至轮转式切片机蜡块钳内，切片厚度为12 μm（图1G），使用超纯水做展片液，切片烘干后转移至37 ℃恒温箱中保存。

1.3.5 脱蜡与复水

将粘有样品的载玻片置于染缸内，于60 ℃的烘箱内用二甲苯脱蜡3 次，每次30 min。后经过1/2 乙醇+1/2 二甲苯，100%乙醇2 次，95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇、纯水3 次梯度复水，每个步骤停留2 min。复水完成后随即进行染色。

1.3.6 染色

染色采用番红-固绿双重染色法。用0.5%番红溶液染色60 min，然后用纯水泡洗多次，直至染缸内只有微量浮色。脱水重染的步骤是：30%乙醇配合盐酸稀释液分色1 min，50%乙醇、70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、100%乙醇各脱水10 s，其中30%乙醇中加入半滴浓盐酸以利于番红脱色，95%的乙醇中加入固绿粉末配成0.1%固绿溶液进行复染。

1.3.7 封片

将染色脱水完成的材料经过二甲苯透明后，用中性胶封片。封片后将玻片转于37 ℃恒温箱中烘干，随后进行显微观察。

2 结果与分析

2.1 试验方法优化结果

与传统方法相比，改良的石蜡切片方法在材料处理及主要步骤等方面进行了诸多优化，并对各处理阶段所需时间进行了总结（表1～2）。

表1 常规石蜡切片与改良后石蜡切片方法对比Table 1 The comparison of traditional and improved paraffin section

表2 各步骤材料处理时间对比Table 2 the time comparison of material processing

运用改良的方法制作石蜡切片，增加体式显微镜下处理过程后，消除了因油桐生理结构特性引起浸蜡不充分所导致的材料破损易碎问题，使材料与石蜡结合紧密。脱水时间减少1 h，透明时间缩短0.5 h，避免了透明与脱水时间过长会导致材料变硬变脆的问题。浸蜡时间延长了16 h，缩短二甲苯与石蜡混合液的处理时间，避免频繁更换二甲苯导致的去除不彻底以及浸蜡不充分，增加样品与石蜡的结合度。这一改进不仅提高了切片制作的效率，还很大程度的减少了二甲苯对实验操作者的危害[31]。染色及脱水重染时，缩短各溶液处理时间，避免染色过度和因分色时间过长导致的染色不均。

2.2 材料处理优化结果

油桐花序去除了多余苞片、分支以及密实缠绕在小花萼片外的绒毛，使样品在保持主要结构不变的情况下尽可能的减少了无用组织，去除绒毛使得药液和蜡液更易进入材料内部，避免了由于油桐花序苞片紧实，绒毛极多所导致的脱水、浸蜡不充分等现象（图1I 常规方法效果、图1J 改良方法效果）。

2.3 脱水透明改良结果

脱水透明的目的是为了能更好地浸蜡与染色，在这步操作中是按照从低浓度到高浓度依次进行。大量的试验经验表明，脱水透明的时间不宜过长，二甲苯透明时间过长会使材料变硬变脆[32]。与常规脱水时间相比，改良后的乙醇脱水时间缩短了1 h， 当脱水后的材料放入纯二甲苯时未出现白色雾状浑浊，说明材料脱水充分。因此，对油桐花芽选取5 h 的脱水和透明时间，既能脱水彻底又能缩短试验时间，还能避免因脱水透明时间过长引起的材料变硬变脆问题（表1～2）。

2.4 浸蜡包埋改良结果

浸蜡包埋的目的是用石蜡取代透明剂，并固定样品便于切片。理想的处理效果是石蜡可以与材料形成密不可分的整体，切片时能得到完整和连续的蜡带。改良试验方法延长浸蜡时间为1 d，使大体积材料也能浸蜡充分；与常规方法相比，改良的包埋过程选择在恒温烘箱中进行，保证器械与材料温度一致，避免了二者产生温差导致材料中产生气泡的不良现象，保证材料的完整性（图1E、1F）。

2.5 染液浓度与染色时间优化结果

油桐小花组织幼嫩，细胞核大质浓，番红极易着色，若染色液浓度过高或染色时间过长，则细胞因着色过深而难以分色，细胞核质不甚分明。改良方法中，采用0.5%的番红溶液染色1 h，配合盐酸稀释液分色1 min，0.1%固绿溶液复染，染色后的切片细胞核颜色红亮鲜艳，核质分明，细胞间轮廓清晰，不论是花序的整体形态结构，还是不同组织的细胞结构，均清晰可见（图1M 常规方法效果、图1N 改良方法效果）。

2.6 改良方法效果验证

为验证此改良方法是否适用于油桐大花序，选取了横纵径1 cm 左右的花序若干朵，花序中小花数大于40 朵。其中一枚花序沿主轴顶花纵切后用体视镜观察，初步确定此时花序处于雄蕊原基发育时期（图1H），剩余花序进行石蜡切片制作。图1 K为使用常规方法制作的切片，可见材料破损，石蜡与材料之间有缝隙，样品中空洞明显；图1L为使用改良方法制作的切片，切片后可见材料与蜡带成为密不可分的整体，材料结构完整。样品经染色后，图1M 为常规方法染色后的切片效果，可见样品中空洞明显，材料破损，材料外围的苞片浮起，影响显微观察；图1N 为改良方法获得的切片，可见切片轮廓完整，细胞结构清晰，核质分明，说明该石蜡切片方法适用于油桐大花序。

3 结论与讨论

改良的油桐花序石蜡切片制作方法为：将采下的油桐花序简单剥去苞片后立即投入FAA 固定液中抽气30 min，固定24 h 后更换70%乙醇于4 ℃ 冰箱中保存；样品剥尽苞片，去掉多余花序轴，用毛刷刷去萼片外大部分绒毛后，经85%乙醇 （1 h）、95%乙醇（1 h），100%乙醇（1 h）脱水处理。二甲苯与乙醇等比例混合液（1 h）、纯二甲苯（1 h）透明。将透明好的样品转移到盛有石蜡与二甲苯等体积混合液的小坩锅中，于55 ℃烘箱中处理2 h 后更换纯蜡，其后更换3 次以上纯蜡，浸蜡温度为60 ℃。浸蜡完全的样品置于盛有石蜡的塑料包埋盒中，然后于60 ℃烘箱中处理30 min 后取出，常温冷却凝固。蜡块修整后进行切片，厚度为12 μm。使用超纯水做展片液，在40 ℃的展片机上展片并烘干多余水分。在60 ℃烘箱中脱蜡后快速梯度复水，0.5%番红溶液染色1 h，盐酸稀释液分色，0.1%固绿复染后用中性树胶封片。获得的切片完整且厚度适宜，浸蜡充分且脱蜡均匀彻底，染色后的切片组织结构完整清晰，色彩分明。

大量的研究表明，脱水透明的时间不宜过长，在无水乙醇和二甲苯中浸泡时间过长会使材料变硬变脆，从而难以获得结构完整的切片[32-33]。因此，脱水、透明的时间应在保证材料中液体置换充分的情况下越短越好。浸蜡充分与否对石蜡切片能否制作成功至关重要。若浸蜡充分，石蜡则均匀的融入到组织内部，样品与石蜡紧密结合，切片完整成带；否则蜡块中会存在空洞和裂缝，切片时难以获得结构完整的切片。改良后的浸蜡时间比常规方法所需要的时间长，使材料与石蜡更好的结合，将石蜡与二甲苯混合液置于烘箱中，使石蜡更快的溶于二甲苯。另外，脱蜡后的样品在后期复水与脱水重染过程若浸泡时间过长，还会导致样品脱落[34-35]，因此需对乙醇处理时间进行控制。此外，选用诸如蛋清甘油液等粘片剂也可以避免脱片现象发生[34]。在染色过程中选用合理有效且经济安全的染色剂是确保实验成功的根本保证，本实验选用0.5%番红溶液染色，染色效果良好，但染色剂的选择仍有很多备选可能，需要进一步的试验验证。

图1 雄蕊分化时期油桐花序芽Fig.1 Inflorescence buds of tung oil tree during the differentiation of stamen

在实际操作时，同一试验操作方法针对不同植物的同一组织或同一植物上不同部位的组织存在着一定的局限性[36]。油桐花序随着生长发育的进行，其体积大小及内部形态结构发生了很多变化，需要根据其独特的理化特性合理选用具有针对性的处理方式及试验药品。