纤维素降解菌的分离筛选及其对水稻秸秆的降解效果分析

张冬雪,文亚雄,罗志威,郑双凤,谭石勇*

(1.农业农村部 植物营养与生物肥料重点实验室,湖南 长沙 410205;2.重金属污染耕地安全高效利用湖南省工程研究中心,湖南 长沙 410205;3.湖南省生物肥料工程技术研究中心,湖南 长沙 410205;4.泰谷生态科技集团股份有限公司,湖南 长沙 410205)

湖南省是一个水稻产出大省,据2015年数据统计,全省秸秆资源理论总量约为4912.36万t,实际可收集资源量为3632.23万t,其中包括水稻秸秆2628.55万t。秸秆资源的循环利用对改善农业生态环境、降低环境压力具有重要意义。

纤维素是植物细胞壁的组成成分。有研究显示,水稻秸秆中秆部、穗部的纤维素含量分别为39.69%、23.89%。此外,秸秆中半纤维素、木质素等主要成分的存在也使得秸秆的降解率较低[1-2]。目前,针对秸秆降解的方法,主要有直接还田、物理降解、化学降解及生物降解等,相比于其它方法,生物降解法具有处理方式温和、低能耗、对环境无二次污染等优点而备受关注[3]。微生物降解的酶活性高低决定了水稻秸秆被降解的程度,即采用此方法的关键是获得丰富有效的具有降解秸秆能力的微生物菌种资源。因此,我们从湖南望城区稻田土壤中分离筛选纤维素降解菌,并通过一系列实验筛选出了具有高效降解能力的菌株,可为水稻秸秆的资源化利用提供有效的菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 样品采集于湖南望城区稻田土,去除土壤表面植物秸秆等残体杂质,取0～10 cm表层土样,风干、研磨、装袋，冷藏备用。

1.1.2 培养基

1.1.2.1 分离培养基 CMC培养基:羧甲基纤维素钠(CMC-Na) 10.0 g, KH2PO40.25 g,土豆汁100 mL,琼脂粉18.0 g,蒸馏水1000 mL。

1.1.2.2 纯化、保存培养基 PDA培养基:马铃薯200 g,葡萄糖20.0 g,琼脂粉18.0 g,蒸馏水1000 mL。

1.1.2.3 筛选培养基 刚果红培养基: CMC-Na 2.0 g, KH2PO40.5 g, MgSO4·7H2O 0.25 g, (NH4)2SO41.0 g,刚果红0.1 g,琼脂粉18.0 g,蒸馏水1000 mL。复筛培养基: CMC-Na 5.0 g, KH2PO41.0 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, NaNO33.0 g, KCl 0.5 g, FeCl3·6H2O 0.01 g,蒸馏水1000 mL。

1.1.2.4 水稻秸秆液体培养基 CMC-Na 10.0 g, KH2PO41.0 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, NaCl 0.5 g,蛋白胨2.0 g,酵母膏0.5 g,蒸馏水1000 mL,水稻秸秆0.5 g /瓶。

1.2 菌株的分离筛选

1.2.1 菌株的分离纯化 将土壤样品通过梯度稀释用无菌水制成10-3～10-5菌悬液,并在分离培养基上涂布,置于28 ℃恒温培养箱中培养,将分离到的真菌在PDA培养基中进行划线纯化及保存,将保存好的菌种放于4 ℃冰箱保藏。

1.2.2 菌株的初筛 将分离纯化得到的真菌菌株孢子悬浮液涂布于PDA上,于28 ℃恒温培养箱中培养2～3 d,待培养基表面菌落生长均匀时,用5 mm打孔器制成菌饼并接种于刚果红培养基上,置于28 ℃恒温培养箱中培养3～5 d,观察菌饼周围是否有透明水解圈,并测量水解圈直径,每个菌种设置3个重复。

1.3 羧甲基纤维素酶(CMCase)活性的测定

1.3.1 标准曲线的绘制 将无水葡萄糖于80 ℃条件下烘干至恒重,并制备成浓度为1.0 mg/mL的葡萄糖标准液；在6支干净的试管中分别加入葡萄糖标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,补蒸馏水至2.0 mL,再加入1.5 mL DNS试剂，然后沸水浴5 min,冷却后定容至25 mL,最后于波长540 nm下测定OD值,采用Excel绘制标准曲线。

1.3.2 粗酶液的制备 利用初筛得到的真菌菌株制备种子液,按10%的接种量接于复筛培养基中,在250 mL三角瓶中装液90 mL,于28 ℃恒温下振荡培养,分别在3、5、7、9、11 d取发酵液1.5 mL于离心管中,以10000 r/min离心10 min，得到粗酶液,测定各菌株在不同发酵时间下的羧甲基纤维素酶(CMCase)活力,每个菌种设置3个重复。

1.3.3 酶活力的测定 参照李静等的方法[4]进行测定。

1.4 水稻秸秆崩解及降解率的测定

1.4.1 水稻秸秆崩解实验 用剪刀将水稻秸秆剪成约0.5 cm×3.0 cm的条状,用水稻秸秆替代复筛培养基中的碳源(CMC-Na),每瓶装入0.5 g水稻秸秆；按10%的接种量将种子液接于装液量为45 mL/250 mL的三角瓶中,于28 ℃、120 r/min条件下恒温振荡培养,定期观察水稻秸秆的崩解情况。

1.4.2 水稻秸秆降解率的测定 将水稻秸秆粉碎后过40目筛,用水稻秸秆替代复筛培养基中的碳源(CMC-Na),每瓶装入2.0 g水稻秸秆；按10%的接种量将种子液接于装液量为90 mL/250 mL的三角瓶中,以接入10 mL蒸馏水为对照,于28 ℃、120 r/min条件下恒温振荡培养,25 d后,将培养物以5000 r/min离心10 min,弃上清液,用蒸馏水反复清洗3～5次,于80 ℃烘干至恒重,计算失重率,每个处理设置3个重复。

1.5 菌株的鉴定

1.5.1 形态学鉴定 根据有效菌株在PDA平板上的菌落形态进行初步判断。

1.5.2 分子生物学鉴定 对高效降解纤维素的菌株进行DNA提取,并将测序结果在NCBI数据库中进行BLAST比对,在GenBank中寻找相似性最大菌株的基因序列,采用Mega 7.0软件分析并构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离与初步筛选

本文将从土壤样品中分离的真菌菌株,通过刚果红培养基初筛得到6株具有纤维素降解能力的菌株(CAF1、CAF2、CF3、WF5、WAF6、F19)。

由表1分析可知,水解圈直径D与菌落直径d的比值大小反映了菌株在CMC-Na刚果红平板上的生长情况,其中菌株CAF2、F19的D/d值分别为2.99、3.12,说明其相对水解圈直径较大,而CAF2与F19的最高酶活分别为21.06和8.56 U/mL;菌株WAF6、CAF1、CAF2的酶活相对较高,且最高酶活出现时间相同(第5天),但D/d值相差较多;菌株CF3的水解圈直径较小,酶活也相对较小;此外,各菌株达到最高酶活的时间也各不相同。

表1 各菌株降解纤维素能力的评价结果

2.2 菌株对水稻秸秆的崩解效果及降解率

2.2.1 菌株对水稻秸秆的崩解效果 在上述实验的基础上,将上述6个菌株接种于水稻秸秆液体培养基，在培养25 d后鉴定它们降解水稻秸秆的能力，结果如表2所示。从表2可以看出：各菌株在培养0～3 d期间水稻秸秆无明显的形态变化；从第5天开始,经菌株CAF2、WAF6作用的秸秆开始逐渐被降解,其中WAF6在15 d内能够降解绝大部分的秸秆;菌株CAF1、CAF2、F19在20 d内能够崩解约1/2的水稻秸秆。

不同菌株对水稻秸秆的崩解效果如图1所示,在菌株WAF6的作用下,水稻秸秆基本上被降解。

注:“+”表示秸秆被降解较少;“++”表示秸秆被降解1/2左右;“+++”表示秸秆基本被降解;“++++”表示秸秆被完全降解。

图1 各菌株在培养25 d时对水稻秸秆的崩解效果

2.2.2 各菌株对水稻秸秆的降解率 如图2所示,各菌株对水稻秸秆均有一定的降解作用,其中菌株WAF6、CAF2的降解效果较好,降解率分别为45.72%和33.97%；菌株CAF1、WF5、F19的降解率分别为25.22%、18.55%、13.58%；菌株CF3的降解效果最差,仅为2.94%。

2.3 菌株的鉴定结果

综合上述实验结果,对降解水稻秸秆效果较好的1株真菌WAF6进行形态特征描述,以及分子生物学分析。

2.3.1 形态学鉴定结果 WAF6在PDA培养基上的菌落平坦,生长迅速,菌丝起初为白色绒毛状,后随培养时间延长由中间部位开始产生大量暗绿色分生孢子,孢子较易脱落。根据形态特征，初步鉴定其属于青霉属。

2.3.2 菌株系统发育树分析 根据序列测定结果,在GenBank中采用Blast进行检索与同源性序列比对,用Mega 7.0软件构建系统发育树,结果(图3)显示,菌株WAF6与草酸青霉(Penicilliumoxalicum, NR 121232.1)的亲缘关系最近，因此,将菌株WAF6鉴定为草酸青霉(Penicilliumoxalicum)。将该菌株保藏于中国农业微生物菌种保藏中心,保藏号为ACCC 32731。

图2 不同菌株对水稻秸秆的降解率

图3 基于序列测定结果的不同菌株的系统发育树

3 讨论和结论

利用微生物降解处理秸秆等农业废弃物,纤维素降解菌的筛选是基础。目前,分离筛选纤维素降解菌的相关研究已有较多报道,从研究中可以发现降解纤维素细菌主要包括芽孢杆菌属、短杆菌属、类芽孢杆菌属等[5-8];真菌包括木霉(绿色木霉)、青霉、曲霉(棘孢曲霉、黑曲霉、米曲霉等)[9-11];放线菌包括链霉菌属等[12-14]。

在纤维素降解菌的筛选过程中,微生物种类不同会导致产酶活性和其对不同秸秆的降解能力也存在较大差异,因此,应注重筛选与评价方法的综合应用。在本研究中,采用刚果红平板培养法初步筛选出6株真菌,测量并计算出各菌株的水解圈直径D与菌落直径d的比值(D/d)，以此指标作为参考,在后续的CMCase实验中发现,有些比值(D/d)大的菌株酶活较高，而有些菌株则相反,即比值(D/d)大,但酶活较低,说明各菌株在CMC-Na刚果红平板上形成的水解圈大小与CMCase活力之间无显著的相关性。这与李静等的研究结论相似,即刚果红培养基上产生的水解圈只能定性判断某菌株是否具有CMC降解能力[4]。于慧娟等[15]在秸秆降解菌的研究中采用透明圈直径与菌落直径的比值初步判断菌株产纤维素酶的能力,其认为比值越大,产酶能力越强。

本研究采用CMC-Na酶活力法测定纤维素酶活力,该方法具有反应时间短、能够排除干扰因素的影响等优点[16]。通过分析酶活力及秸秆降解率发现,酶活力大小与水稻秸秆降解率具有相关性,即菌株产纤维素酶能力是秸秆降解的主导因素,因此,在对纤维素降解菌的筛选研究中，还应着重于菌株产酶情况的研究。本实验结果表明,菌株WAF6对水稻秸秆的降解率最高,为45.72%;CMCase活力在培养的第5天达到最大值,为29.35 U/mL。经形态学及分子生物学手段将菌株WAF6鉴定为草酸青霉(Penicilliumoxalicum)。穆春雷[17]从玉米秸秆还田地区筛选出的1株草酸青霉菌能够在低温下高效降解纤维素,在摇床发酵培养第9天时,CMCase活力最高，达33.08 U/mL;王洪媛等[18]所筛选的草酸青霉菌株98MJ在培养5 d后,其对由小麦秸秆制备的秸秆木质纤维素的失重率为26.8%。此外,我们在镉污染土壤培育模拟实验中还发现，本文所筛选菌株WAF6能够有效降低土壤中有效镉含量(未附数据),由此表明该菌株在秸秆降解与重金属污染修复方面均具有一定的研究开发潜力。