不同黑胫病发病程度烟株生理特性的比较分析

史普酉，贾 孟，杨成翠，杨 祥，谭小兵，詹 淳，张金峰，王 戈*

(1.云南农业大学 烟草学院，云南 昆明 650201；2.云南省保山市烟草公司 昌宁分公司，云南 保山 678100；3.云南省曲靖市烟草公司 罗平分公司，云南 曲靖 655800)

烟草黑胫病(Phytophoraparasiticavar.nicotiana)是烟草上普遍发生的土传性真菌病害，可通过菌丝、孢子囊和游动孢子侵染烟株，导致烟叶自上而下变黄、凋萎、枯死等[1-2]。我国每年因烟草黑胫病造成的经济损失巨大，严重影响了烤烟生产质量。因此，在烟草植株田间不同发病条件下，探讨不同发病程度植株光合特性及抗氧化酶活性的差异，有助于进一步丰富黑胫病抗性机理，为科学防治黑胫病提供理论依据。研究表明，病原菌侵染植株后会涉及病原菌和植株之间的复杂作用关系。病原菌入侵后，植物体内会形成一系列复杂防御机制抵御病原物的入侵和扩展，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)等植物体内重要的保护酶会积极参与活性氧清除及酚类、木质素和植保素等抗病相关物质的合成，对抵御活性氧及氧自由基对细胞系统的伤害和增强植物抗病能力具有重要作用[3]。同时，病原菌的入侵，在烟株与病原物发生非亲和作用时，寄主体内保护酶活性较低，导致O2-、H2O2大量积累，并逐渐导致细胞膜结构完整性丧失，引发体内一系列生理生化代谢失衡、光合能力降低等现象[4]。烟株感病后，生物因子和非生物因子等多种诱导因子可以诱导植物体内防御酶活性升高以及叶绿素含量等生理指标的改变，继而引起植株体内代谢物质的改变，形成的代谢物本身具有抗病作用或者进一步转化形成与抗病性有关的次级代谢物[5-6]。光照是植物进行光合作用的基础，植物光合生产能力与光合色素、净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度等因素密切相关[7]。魏明月等[8]研究表明，光环境对烟草不同生育期光合作用、干物质积累有显著影响，强光条件下未出现光抑制的现象更有利于烟草的生长发育。当植物遭受病害胁迫时，植物体内的一系列生理机制将形成一些适应方法，同时也形成多种防御机制，构成严密的防御系统。小麦感染白粉病菌后，相对叶绿素含量、光合速率及可溶性蛋白含量均不同程度地降低[9]。杜国栋等[10]在对苹果褐斑病的研究中发现，苹果褐斑病病菌侵染引起的光系统PSII反应中心、PSII受体侧和供体侧的伤害，导致叶肉细胞CO2同化能力下降，进而造成叶片净光合速率不断下降。同时，也有研究指出，番茄幼苗在受到胁迫的情况下叶片会变大、变薄以便于吸收更多光能用于光合作用[11]；棉花苗期受到胁迫后则通过抑制生长以降低能力消耗的方式抵御胁迫[12]。

烟草是以收获叶片为主的经济作物，病原菌的侵入导致叶片产量、品质的下降，目前有关烟叶黑胫病害的研究大多围绕品种抗性鉴定、病原菌分化和拮抗菌选育上，而有关病原菌侵入后导致光合特性改变的研究较少涉及[4,13]。从以往研究方法上来看，更多采用室内或田间等人为干扰形式探讨病原菌侵染的影响[14]，这与病原菌田间实际侵染和植株响应存在一定的差距。在田间病原菌自然侵染并导致植株发生响应条件下，探讨植株自然发病情况下植株的抗性响应相关研究较少涉及。本研究选择云南烟区烟草黑胫病发病典型地区，在控制其他栽培条件基础上，选择同一地块中不同自然发病程度烟株，比较不同发病程度烟株叶片抗氧化酶活性和光合特性的响应差异，探讨不同发病程度与植株相关生理指标变化之间的相关性，以期进一步丰富烟株黑胫病感病机理，为今后科学防治黑胫病提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验概况

1.1.1 取样烟田背景情况 选定烟草黑胫病危害较为严重的3个区域进行定点监测(烟田种植情况如表1所示)，即云南省石林县板桥镇(北纬24°41′28″、东经103°15′28″，海拔1670 m)、云南省昌宁县珠街镇(北纬25°8′7″、东经99°53′42″，海拔1950 m)和云南省昌宁县耇街镇(北纬25°0′35″、东经99°50′14″，海拔1690 m)。各区域定点一块烟田进行跟踪监测，供试土壤均为红壤，品种为红花大金元，供试田块施肥措施及田间管理一致。

表1 不同烟区黑胫病发病情况

1.1.2 取样处理设置 参照烟草病虫害分级及调查方法[15]对烟株进行黑胫病等级划分并基于病情指数调查结果将烟株划分为不同发病程度烟株(图1)，即正常烟株：全株无病；轻度发病烟株：茎部病斑不超过茎围的1/2，或半数以下叶片出现轻度凋萎及下部少数叶片出现病斑；中度发病烟株：茎部病斑超过茎围的1/2，或半数以上叶片出现轻度凋萎及少数叶片出现病斑；重度发病烟株：茎部病斑环绕茎围，或2/3以上叶片出现凋萎。

1.2 抗氧化酶活性测定

在各定点烟田，参照上述不同发病程度划分标准进行田间取样和相关指标测定，具体方法为同一烟田同一发病程度选择3株。将叶片去除叶脉后放入液氮罐保存，待测叶片酶活性，酶活性测定方法参照高俊凤[16]的方法。

1.3 烟叶光合特性测定

于云南省昌宁县耇街镇监测点，选择同一发病程度最有代表性的3株烤烟，在其中部定点选取一片叶片，用软毛刷刷去中部叶表面的灰尘，然后用LI-6400型便携式光合仪(Li-COR lnc，美国)并应用Li-6400-02B蓝红光源探头进行光合响应曲线的测定，取3株烤烟叶片平均值进行数据分析。

图1 各发病程度烟株取样情况

1.4 数据处理

试验数据利用Microsoft Office 2016 初步处理和作图，利用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析；同时基于课题组前期光响应曲线拟合结果[17]，采用双曲线修正模型[18]对烤烟光响应曲线进行拟合，得出相关光合特征参数，该模型的表达式为：

式中：β、γ为系数。参数初始值及限制设定范围为：α=0.01，β=0.0001，γ=0.001，Rd=0.3 μmol/(m2·s)；α≤1，β≤1，γ≤1，Rd≤1.5 μmol/(m2·s)。

2 结果与分析

2.1 不同发病程度烟株烟叶抗氧化酶活性差异分析

不同发病程度烟株烟叶抗氧化酶活性存在较大差异，且不同取样点趋势基本一致(图2)，即随着烟株黑胫病病情加重，POD和SOD活性呈先增加后降低的趋势，其中POD活性在中度发病时达到峰值，且中度发病烟株显著高于正常烟株；SOD活性在轻度发病时达到峰值，并显著高于正常烟株；PPO活性和MDA含量呈持续上升趋势，重度发病烟株均显著高于正常烟株。以上结果表明黑胫病菌侵染烟株会引发烟叶体内抗氧化系统发生较大变化，且不同发病程度烟叶间存在差异。

2.2 不同黑胫病发病程度烟株光合特性变化差异分析

2.2.1 不同黑胫病发病程度烟株净光合速率的变化特征 从光合拟合曲线来看(图3)，在弱光条件下，各处理的测量值和拟合值基本保持一致，在弱光阶段PAR<500 μmol/(m2·s)时，各处理净光合速率的表现为正常烟株>中度发病烟株>重度发病烟株>轻度发病烟株；当PAR>500 μmol/(m2·s)时，各处理的烤烟均达到光饱和点，且正常烟株的净光合速率最大，重度发病烟株最小。

2.2.2 不同黑胫病发病程度烤烟气孔导度的变化特征 不同发病程度烟株烟叶气孔导度与净光合速率的变化趋势基本一致，即正常烟株>轻度发病烟株>中度发病烟株>重度发病烟株(图4)。以上结果表明，随着烟株黑胫病发病情况的加重，烟株气孔导度减小。

2.2.3 不同黑胫病发病程度烤烟胞间CO2浓度和气孔限制值的变化特征 随着黑胫病发病情况加重，烟叶胞间CO2浓度下降，气孔限制值升高，具体表现为正常烟株>轻度发病烟株>中度发病烟株>重度发病烟株(图5)。当PAR小于500 μmol/(m2·s)时，各处理气孔限制值升高，大小表现为重度发病烟株>中度发病烟株>轻度发病烟株>正常烟株，表明气孔因素会影响烤烟的净光合速率；当PAR大于750 μmol/(m2·s)时，各处理胞间CO2浓度开始升高，气孔限制值开始降低，表明非气孔因素会影响烤烟的净光合速率，大小与PAR小于500 μmol/(m2·s)时一致。

图2 不同发病程度烟株叶片酶活性差异

图3 不同黑胫病发病程度烟株净光合速率的变化特征

2.2.4 不同黑胫病发病程度烤烟表观光能利用率的变化特征 随着黑胫病发病情况加重，烟叶表观光能利用率下降，具体表现为当PAR小于500 μmol/(m2·s)时，大小为正常烟株>中度发病烟株>重度发病烟株>轻度发病烟株；当PAR大于1000 μmol/(m2·s)时，大小为正常烟株>轻度发病烟株>中度发病烟株>重度发病烟株(图6)。以上结果表明，随着黑胫病发病程度的加重，烟株表观光能利用率降低，从而导致烟株光合能力下降。

2.2.5 不同黑胫病发病程度烤烟表观CO2利用效率的变化特征 随着黑胫病发病情况的加重，烤烟表观CO2利用效率下降，即在弱光阶段PAR<500 μmol/(m2·s)时，各处理表观CO2利用效率的趋势为正常烟株>中度发病烟株>重度发病烟株>轻度发病烟株；当PAR>500 μmol/(m2·s)时，各处理的表观CO2利用效率大小为正常烟株>轻度发病烟株>中度发病烟株>重度发病烟株(图9)。以上结果表明，黑胫病的发生会导致烤烟表观CO2利用效率降低，病情越严重，表观CO2利用效率越低。

图4 不同黑胫病发病程度烤烟气孔导度的变化特征

图5 不同黑胫病发病程度烤烟胞间CO2浓度和气孔限制值变化特征

图6 不同黑胫病发病程度烤烟表观光能利用率的变化特征

3 讨论

本研究在3个典型黑胫病危害烟区，参照黑胫病病害调查方法对田间自然发病烟株进行发病程度划分，在田间自然发病条件下探讨不同发病程度烟株抗氧化酶活性和光合特性的差异，旨在最大程度减少人为干扰，避免实验室人工接种等方法对结果的影响，更真实呈现田间发病烟株状况及不同程度发病烟株体内抗氧化酶活性和光合特性的差异，以期为丰富烟株抗病机理和今后防治黑胫病提供必要的理论支撑。

图7 不同黑胫病发病程度烤烟表观CO2利用效率变化特征

外界胁迫会诱发植株自身防御系统的积极响应，其中植株保护酶系统在其中扮演着重要角色[19]。当受到病原菌入侵时，烟株体内会产生大量的活性氧，造成膜系统的损伤，同时烟株也可以通过调动保护酶以抵御和清除活性氧，抵制膜脂过氧化，维持膜系统的稳定[20-21]。SOD、POD和PPO是植物在逆境条件下酶促防御系统的关键酶，可作为表征植物抗逆性的指标[22-23]。MDA是植物在逆境环境下膜脂过氧化作用的最终产物，其含量是膜脂过氧化程度的重要标志[24-25]，与细胞膜的损害程度直接相关，其含量的多少可以反映出细胞受到胁迫程度的高低以及烟株抗逆能力的强弱[26]。因此，探讨不同发病条件下植株抗氧化酶活性的差异具有重要意义。在对青枯菌与赤星病菌侵染烟草的研究中发现，受侵染植株叶片POD活性均高于正常植株[6，27]；王戈等[3]的试验也表明，黑胫病病菌侵染烤烟品种红花大金元后，POD活性先上升后降低，与本试验研究结果相同，这可能是因为随着黑胫病发病程度的加重，细胞中积累了大量的活性氧，红花大金元为易感黑胫病品种，对黑胫病入侵表现出的敏感性较低，POD含量虽然随之增加，但并未将其及时清理，最终导致细胞膜系统受到损害。对根黑腐病侵染辣椒的研究发现[28]，辣椒多酚氧化酶活性随着病菌的入侵先上升再下降，与本试验研究结果一致，这可能是在发病后期，植株根系多数死亡造成的。本试验结果表明，SOD活性先上升再下降，在轻微发病时达到最高值，这与匡传富[29]和房保海等[30]的研究结果一致，这可能是由于病菌的入侵造成了活性氧的积累，活性氧有利于激活和调控烟草体内各种防御相关基因的表达[31]，接种后红花大金元SOD活性快速上升，这种高活性水平的SOD可以清除植物和病原物亲和性互作产生的O2-，即红花大金元受到病原物侵染后不发生过敏性反应，病原物可以在寄主内扩展，尔后随着发病程度的加重，植株正常生理代谢受到影响，SOD活性降低。江彤等[4]通过对黑胫病菌侵染抗病烟草品种K326的研究表明，MDA含量会随时间的延长而降低。但本试验结果显示，丙二醛含量呈现持续上升趋势，原因是植株在受到黑胫病菌侵染后，寄主体内SOD、CAT活性较低，导致O2-、H2O2大量积累，进一步启动膜脂过氧化作用，使得MDA含量上升，而品种K326对黑胫病抗病能力强，随着时间的推移，入侵的黑胫病菌被植株免疫系统清除，MDA含量随之下降，而本试验选用的品种红花大金元对黑胫病抗性低，植株无法清除入侵的黑胫病菌，MDA含量持续增高。本研究中，烟株感染黑胫病后，体内抗氧化酶活性发生明显变化，说明在病原菌的诱导下，植株体内活性氧产生和消除机制遭到破坏，大量活性氧积累诱发了抗氧化酶活性激增以此提高抗氧化能力，这也与王戈[3]的研究结果一致。

光照是植物进行光合作用的基础，影响着植物在光合作用过程中同化力形成所需的能量、光合作用关键酶的活化、气孔的开放以及调节光合机构的发育[8]。通过光合仪进行光合响应曲线的测定对研究植物生长规律及光合效率特征具有重要作用[32]。常用的光响应曲线拟合的模型主要有直角双曲线、非直角双曲线、双曲线修正与指数模型[33]，但前人研究结果表明，在烤烟[34]、小麦[35]、玉米[36]上双曲线修正模型拟合效果最好，故本研究基于双曲线修正模型研究了不同黑胫病发病程度烤烟光合特性差异。

一般认为，病害胁迫引起植物光合作用下降的影响因素主要包括两类，由于气孔的部分关闭导致的气孔因素和叶肉细胞光合活性的下降导致的非气孔限制因素。Farquhar认为，在气孔导度下降，而胞间CO2浓度维持不变甚至上升的情况下，叶肉细胞同化能力降低等非气孔因素是引起光合速率下降的主要原因[37]。本研究结果表明，随着黑胫病发病程度的增加，植株气孔导度和净光合速率下降，胞间CO2浓度升高，说明随着黑胫病发病程度的增加，净光合速率的下降是由于非气孔因素导致的，这与柯思佳的研究结果一致[7]。同时，本试验研究发现，随着黑胫病发病程度的增加，Rd值相应升高，这可能是由于烟草植株营养物质被病菌消耗，加剧了烤烟消耗自身物质，不利于干物质的积累。胞间CO2浓度与气孔导度显示，随着烤烟黑胫病发病程度的逐步加重，胞间CO2浓度与气孔导度均逐渐降低，气孔限制值增加，这可能是因为黑胫病毒素为多元半乳糖醛酶，该酶能够分解寄主细胞的中胶层和导管壁，产生果胶产物碎块，从而阻塞烟株根部水分的上升[38]，从而使烤烟植株水分传输能力和水气交换能力降低，对水分的利用能力降低，有机物合成减少[39]。烤烟的表观光能利用率和表观CO2与植株光合作用强度也有紧密的关系。表观光能利用率与CO2利用率随着黑胫病发病程度的加重而降低，这可能由于黑胫病发病时茎、叶上形成大量病斑，烟株下垂，甚至干枯坏死，导致植株利用光能和CO2能力降低。

综合来看，前人[40-41]通过接种病菌的方式对烟草叶片酶活性及光合特性的变化进行了深入的研究，但均止步于接种实验受酶活性及光合特性的影响，人工创伤接种时会损伤茎表皮，不利于烤烟抗病性的表现且并不能真实反映出病菌在自然条件下对烤烟生长发育的影响。本试验在大田中对不同发病程度烟株进行取样，更接近烤烟自然生长状态，更能准确地反映不同发病状态下烤烟生长状态的差异。本文只研究了易感黑胫病烤烟品种红花大金元叶片酶活性及光合特性对不同黑胫病发病程度的响应差异，但其他烤烟品种对不同黑胫病发病程度的响应可能不同，这也可能是不同品种抗黑胫病能力较强的原因，因此，品种间对不同黑胫病发病程度响应的差异有待进一步研究。

4 结论

试验结果表明，不同发病程度烟株烟叶抗氧化酶活性存在较大差异，其中POD与SOD活性随着黑胫病发病程度的加重表现为先增高后降低的趋势，PPO活性与MAD含量均随黑胫病发病程度的增加呈持续上升趋势。黑胫病侵染烤烟植株显著抑制了光合作用，降低了植株利用光能和CO2的能力。