石油污染土中微生物的分离鉴定及降解特性

2020-03-11 07:23:30张娟方祥位刘汉龙肖杨张楠曹小方

土木与环境工程学报 2020年1期

张娟，方祥位，刘汉龙，肖杨，张楠，曹小方

(1.重庆大学 a.产业技术研究院；b.土木工程学院；c.山地城镇建设与新技术教育部重点实验室，重庆 400045；2.重庆工商大学通识学院，重庆 400020)

石油是一种重要的能源，对经济和人民的生活水平都有很大的推动作用，但在石油的开采、加工以及运输过程中会发生石油泄漏等问题，资料表明，中国目前直接进入到环境中的石油约有6×105t，对土壤以及地下水造成严重污染。而汽油是用量最大的轻质石油产品之一，汽油物质进入土壤后，主要从两个方面对土壤的理化性质造成影响：一是会影响土壤的通透性，使得土壤的结构遭到破坏[1]；二是汽油中的反应基能够与土壤中的无机氮和磷结合并限制土壤的硝化作用和脱磷酸作用，导致土壤中有机质的碳氮比和碳磷比增大[2-4]。此外，汽油中的某些烃类具有致病变、致癌甚至致畸形的作用，通过污染土进入人体后，大量积累会严重危害到人体的健康[5]。因此，汽油污染土的治理和修复一直受到高度重视。

传统的污染土治理方法有物理法和化学法，物理修复法主要有挖掘填埋法、电解法、洗涤法和气体吹脱法等，但物理法所用的设备价格昂贵且可能破坏土壤的结构和组分。化学法主包括氧化剂氧化法、萃取法、热分解法和光化学氧化法等，主要技术是利用化学浸出进行除油，但此方法有可能对土体造成二次污染[6]。

生物修复法是一种绿色节能的方法，主要利用微生物及其他生物，将土壤中的有毒烃类污染物降解为二氧化碳和水等无毒无害物质，从而达到修复土壤的目的[7]。研究发现，有大量微生物能够以石油中的烃类作为唯一碳源进行繁殖生长，微生物繁殖较快且比表面积大，因此，微生物修复污染土成为研究热点[8]。目前，关于原油生物降解的研究主要集中在降解菌的筛选与鉴定[9-10]和生物降解机理[11-12]。闫志宇等[13]分离筛选出的菌株BacillussubtilusL3能高效降解乙草胺。Guo等[14]从柴油污染的土壤中分离出两种耐寒的石油烃降解菌株CHD1和CHD2。而汽油作为用量最大的石油提取物，对土壤造成的污染也最多。

已有研究表明，多种微生物都能对汽油烃类物质进行降解，但降解能力存在较大差异，因此，筛选降解汽油烃能力较强的菌种将会大大提高污染土的修复效率[15]。笔者通过从石油污染土中的微生物进行分离鉴定以及通过正交试验和响应面分析对其降解汽油性能进行测定和优化，从而为汽油污染土的生物修复法提供优良菌种。

1 材料与方法

1.1 土壤样品

石油污染土来源于甘肃省成县油气管道转换站，图1所示为采集的土样。主要取自表层以下2～15 cm处的污染土。

图1 汽油污染土

1.2 培养基

LB培养基：酵母浸出粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L，琼脂15 g/L，配制200 mL，pH值调节为7.0，121 ℃灭菌20 min。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种的分离与鉴定称取石油污染土1.0 g放入到装有9.0 mL的无菌生理盐水的试管内，在漩涡混合器中充分混匀，此时，溶液的稀释度为10-1。利用梯度稀释法对其继续进行稀释，稀释的梯度分别为10-2、10-3、10-4和10-5。用移液器从10-3、10-4和10-5这3个梯度中吸取20 μL的稀释液，然后，在超净工作台内将其接种到灭菌过的LB培养基中进行涂布，涂布均匀后，将培养基放入32 ℃的培养箱内倒置培养24 h[16-17]。培养完成后，观察并记录菌落形态，挑取不同形态的单菌落接种到固体培养基中，重复多次。对菌种进行纯化后，分别进行生理生化实验，然后，将纯化后的菌株接种于相应的培养基斜面，在培养箱内培养24 h后，保存于4 ℃的冰箱内。对每个菌种的DNA进行提取[4,18-19]，利用细菌的通用引物进行PCR扩增，得到约1 500 bp条带后，通过Sanger法进行测序(擎科兴业生物有限公司完成)，将得到的序列利用BLAST软件与GenBank数据库中的序列进行同源性比对，从而确定菌株的类别。

1.3.2 优良降解菌株的筛选将纯化后的菌种在超净工作台内接种到200 mL的LB液体培养基中，然后置于32 ℃、180 r/min的摇床内进行扩大培养，培养24 h后，测定菌液在600 nm处的吸光度。吸取2 mL菌液，接种到200 mL的降油培养基内，同样在32 ℃、180 r/min的摇床内进行培养，在培养2、4、6 d后，分别对培养基内的汽油含量进行测定，并计算最终的汽油降解率。每个菌种做3组平行试验，结果取平均值，从而对具有高效汽油降解能力的菌种进行筛选。

1.3.3 汽油降解率的测定方法将降解后的培养液放入离心机内离心(转速为100 r/min)，20 min后提取上清液到新的灭菌过的锥形瓶内，每1 L上清液加入5 mL硫酸进行酸化，然后加入40 mL的石油醚，将培养基内残余的汽油提取后对其质量进行测定，汽油降解率的计算式为[20]

汽油降解率=(m0-m1)/m0×100%

式中：m0为初始汽油的质量；m1为培养基中残余的汽油质量。

1.3.4 菌种降解性能的测定

1)单因素试验以LB培养基作为基质，按照表1的3组实验方案进行菌种的培养，培养20 h后，吸取20 μL菌液加入到降油培养基内培养6 d后，对培养基中残余汽油含量进行测定，计算并记录汽油降解率。

2)在单因素试验的结果之上，对具有高效汽油降解能力的菌种进行三因素三水平的正交实验，然后按照实验方案所列的培养条件进行培养[3,21]。利用Design-expert软件对实验结果进行分析以及最优求解从而确定菌种降解汽油的最佳培养条件。

表1 单因素试验方案

2 结果与分析

2.1 汽油降解菌的分离与鉴定

从汽油污染土中共分离出9株菌株，除了菌1和菌5形态特征较为明显之外，其余在平板上的特征较为相似。将这9种菌株进行编号为菌1～菌9，并对其进行形态学观察，这9种菌上的特点见图2。

图2 菌落在平板上的形态特征

对每种菌进行分离纯化后进行生理生化实验,结果如表2所示。

对刀操作是数控车床加工调试的关键所在,是保证车床正常运行的重要步骤。在实际操作中，深入了解对刀的原理和方法，能减少因机械原因造成的零件报废，提高生产效率和零件的车削质量。

利用NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的Blast对测序结果和己知序列进行比对，分析其相似度，具体的鉴定结果为：菌1为铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，菌2为假单胞菌属(Pseudomonas)，菌3为苍白杆菌属(Pleurobacter)，菌4为博得特氏菌属(Bordetella)，菌5为戈登氏菌属(Gordonia)，菌6为同温层芽孢杆菌(Bacillus)，菌7为洛菲不动杆菌(Acinetobacter)，菌8为琼氏不动杆菌(Acinetobacterjunii)，菌9为暹罗芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，且相似率均大于99.9%。

表2 菌株的生理生化反应特点Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strains

注：“+”表示阳性；“—”表示阴性。

2.2 优良降解菌的筛选

对9株菌在降油培养基内培养6 d后的汽油降解率进行测定,结果见表3。

根据表3可知，菌1、2、3、4、5的汽油降解率均超过60%，证明菌1、2、3、4、5降解汽油的能力较好，即铜绿假单胞菌、假单胞菌菌属、苍白杆菌属、博得特氏菌属以及戈登氏菌属对汽油有着较好的降解能力，且这5种菌无致病性，对环境无污染性。

表3 9株菌株的汽油降解率

2.3 菌株降解性能的测定

2.3.1 单因素试验结果培养温度对5种菌的汽油降解率的影响如图3所示。由图3可知，培养温度对5种菌的汽油降解率的影响趋势大致相同，当温度小于35 ℃时，随着培养温度的升高，汽油降解率呈现上升趋势，当温度大于35 ℃，汽油降解开始下降，对于这5种菌来说，35 ℃是较为合适的培养温度。

图3 培养温度对5种菌汽油降解率的影响

培养基的pH值对5种菌的汽油降解率的影响如图4所示。由图4可知，培养基pH值对5种菌的汽油降解率的影响趋势大致相同，除了菌4在培养基pH为7.5时汽油降解率达到最大值，其余4种菌均在培养基pH为7时，汽油降解率达到最大值。

图4 培养基pH值对汽油降解率的影响

培养时间对5种菌汽油降解率的影响如图5所示。由图5可知，菌1在培养24 h时汽油降解率达到最大值，超过24 h后开始下降，菌1在20、24 h的汽油降解率较为稳定，但超过24 h后开始下降，其余3种菌的汽油降解率均在培养20 h时达到最大值。

图5 培养时间对5种菌汽油降解率的影响

2.3.2 正交实验结果基于单因素试验结果确定的正交实验的因素和水平如表4所示。

表4 实验因素和水平

根据设计的正交实验方案进行实验后，对每组的残余汽油量进行测定后对汽油降解率进行计算，得到的正交实验结果如表5所示。

将实验数据录入软件进行分析，菌1～菌5的正交实验结果的方差分析如表6～表10所示。