皱纹盘鲍基质金属蛋白酶基因的克隆与表达分析

陈玉磊，李婉玉，吴裕玲，杨汝晴，章 骞,2， 张凌晶，刘光明,2，曹敏杰,2

(1.集美大学食品与生物工程学院，福建 厦门 361021； 2.水产品深加工技术国家地方联合工程研究中心，福建 厦门 361021)

0 引言

鲍鱼隶属于软体动物门(Mollusca)、腹足纲(Gastropoda)、原始腹足目(Archaeogastropoda)、鲍科(Haliotidae)、鲍属(Haliotis)，自古以来就被认为是海洋中最珍贵的美味。鲍鱼已经成为全球水产养殖的一种重要经济品种[1]。据统计，2016年我国鲍鱼产量达到近14万t，比2014年增长9.2%。福建省作为鲍鱼养殖大省，年产量占全国81%[2]。随着水产养殖业的迅速发展，质量管理、疾病预防与控制等相关技术的缺乏容易导致鲍鱼疾病的流行，其中，副溶血性弧菌是导致养殖鲍鱼成活率下降的主要病原菌。感染了副溶血性弧菌的鲍鱼表现为萎缩，从受疾病感染的鲍鱼多样性血淋巴中分离出的副溶血性弧菌可导致幼年鲍鱼的死亡[3]。

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一类活性依赖于锌离子和钙离子的蛋白水解酶[4]。典型的MMPs结构包括：1)疏水信号肽序列；2)前肽区，主要作用是保持酶原的稳定，当该区域被外源性酶切断后，MMPs酶原被激活；3)催化活性区，有锌离子结合位点，对酶催化作用的发挥至关重要；4)富含脯氨酸的铰链区；5)类血红素结合区，与酶的底物特异性有关[5]。不同的MMP具有不同的底物特异性。MMPs的表达由糖皮质激素、类维生素A、病菌感染和外界压力等因素调控[6]，其活性受转录水平、酶原激活和天然抑制剂(tissue inhibitors of MMPs，TIMP)的严格控制[7]。作为降解细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的主要酶类，MMPs能够参与生物体多种生理和病理过程，如胚胎发育、组织重排、免疫反应和疾病发生等[8-9]。目前，对MMPs的研究主要集中于哺乳动物，以水产动物特别是贝类为研究对象的报道较少。因此，本文以皱纹盘鲍(Haliotisdiscushannai)为研究对象，克隆得到3个MMPs(Hdh-MMP-16/17/21)部分基因序列，并对这3个基因进行生物信息学分析及蛋白质高级结构预测。还对Hdh-MMPs在皱纹盘鲍不同组织中的相对表达量及其在副溶血弧菌感染前后基因相对表达量变化情况进行了初步试验，以探究MMPs在皱纹盘鲍免疫调控环节中的生物学功能。

1 材料与方法

1.1 实验材料

大小均一的健康皱纹盘鲍购于厦门市夏商国际水产交易中心，平均质量约40 g，于20 ℃暂养3～4 d后根据相关实验分组进行处理。养殖用海水取于集美大学水产学院养殖场，每12 h更换一次。

1.2 实验动物分组及致病菌处理

实验用皱纹盘鲍暂养后，随机挑取3只鲍鱼，收集血淋巴细胞、肝胰腺、鳃、肌肉、腹足、外套膜和性腺，不同个体相同组织混合后置于液氮备用。将剩余鲍鱼随机分为两组，每组20只，试验组注射副溶血弧菌(2×107CFU)，对照组注射同等体积磷酸缓冲液。注射12、24、48和72 h后，分别随机挑取3只鲍鱼，收集鲍鱼主要免疫器官(血淋巴细胞、鳃、肝胰腺)，不同个体相同组织混合后置于液氮备用。

1.3 总RNA的提取及cDNA合成

按总RNA提取试剂盒(Tiangen)提供的方法提取各组织(血淋巴细胞、肝胰腺、鳃、肌肉、腹足、外套膜和性腺)的总 RNA。使用质量分数1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测产物的完整性，使用NanoDrop ND1000检测RNA浓度及纯度。利用PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TAKARA)将血淋巴细胞mRNA反转录成用于基因克隆的cDNA。将不同组织mRNA浓度调为一致，利用ReverTra Ace®qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(TOYOBO)合成用于荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)的cDNA。

1.4 皱纹盘鲍MMPs 基因克隆

通过拼接NCBI SRA数据库中皱纹盘鲍转录组测序数据(登录号：SRP059307)，得到完整的皱纹盘鲍转录组序列。利用BLAST在线软件预测得到与其他物种MMP同源的Hdh-MMP-16/17/21基因部分序列。用Primer 5.0软件设计Hdh-MMPs特异性引物(见表1)，以皱纹盘鲍血淋巴细胞cDNA为模板进行PCR扩增。 扩增反应体系(20 μL)如下：Taq酶 0.2 μL， 10×buffer 2.0 μL，dNTP(10 mmol/L)2.0 μL，正向引物(10 μmol/L)1.0 μL，反向引物(10 μmol/L)1.0 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 12.8 μL。PCR扩增条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，循环35次；最后72 ℃延伸10 min。 将3 μL扩增产物上样于质量分数1.0%的琼脂糖凝胶，并进行电泳检测。扩增产物经DNA纯化试剂盒(Tiangen)回收后，连接pEASY-T1载体(TransGen Biotech)，并进行转化和菌落PCR，挑取阳性菌落送厦门铂瑞生物科技有限公司测序。

表1 基因克隆所用引物

1.5 生物信息学分析

根据克隆得到的Hdh-MMPs基因序列，利用DNAMAN软件推导Hdh-MMPs氨基酸序列；利用interpro在线分析软件(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)对其蛋白质结构域进行分析；用 NCBI 中 BLAST工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行序列比对和相似性分析；用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白质的理化性质；通过PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)在线预测MMPs蛋白质二级结构；利用DNAMAN软件进行不同物种间同一基因多序列比对。

1.6 qPCR检测Hdh-MMPs基因表达

根据克隆得到的皱纹盘鲍Hdh-MMPs基因序列设计qPCR用引物(见表2)，以 EF-1α作为内参基因，利用TransStart®Top Green qPCR SuperMix(TransGen Biotech)分析Hdh-MMPs基因在皱纹盘鲍各组织及副溶血弧菌感染前后的表达差异性。qPCR反应体系(10 μL)如下：2×qPCR SuperMix 5 μL，正向引物(10 μmol/L)0.2 μL，反向引物(10 μmol/L)0.2 μL，50×Passive Reference Dye 0.2 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 3.4 μL。于ABI 7300仪器(Applied Biosystems)中进行两步法PCR扩增，程序如下：94 ℃预变性30 s；94 ℃变性5 s，60 ℃延伸31 s(荧光采集)，循环40次；扩增结束后，从55 ℃升温至94 ℃制备溶解曲线。每个样品设置3个重复，每组反应均设置无模板对照。

表2 qPCR所用引物

1.7 数据处理

运用Graphpad Prism 5软件处理数据及图表绘制，采用单因素方差分析法(One-way ANOVA)进行统计分析，显著性水平为P<0.05，极显著性水平为P<0.01。

2 结果

2.1 Hdh-MMPs基因的克隆及序列分析

通过拼接NCBI SRA数据库中皱纹盘鲍转录组测序数据(登录号：SRP059307)[10]，得到完整的皱纹盘鲍转录组序列。利用BLAST在线软件预测得到与其他物种MMP同源的Hdh-MMP-16/17/21基因部分序列。通过PCR扩增，克隆得到Hdh-MMP-16、Hdh-MMP-17和Hdh-MMP-21 cDNA编码区部分序列。Hdh-MMP-16片段长度1150 bp，编码383个氨基酸残基，包含MMP完整的催化区和肽聚糖结合结构域(见图1a)。Hdh-MMP-17和Hdh-MMP-21片段长度分别为1913 bp和2112 bp，分别编码636和703个氨基酸残基，包含MMP完整的催化区、肽聚糖结合结构域和类血红素结合区(见图1b和图1c)。氨基酸序列分析表明，Hdh-MMP-16/17/21 3个蛋白质均含有保守结构片段，即位于催化结构域的催化活性中心HEXGHXXGXXH序列(见图1)。

2.2 Hdh-MMPs蛋白质特性和结构分析

根据ProtParam预测结果，克隆得到的Hdh-MMP-16蛋白质相对分子质量为42.28 ku，理论等电点为9.39。基因编码的383个氨基酸中，带有正电荷的碱性氨基酸精氨酸(Arg)和赖氨酸(Lys)共52个，带有负电荷的酸性氨基酸天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)共42个。该蛋白质的不稳定系数和疏水值分别为 33.89 和-0.670，是一种稳定的亲水性蛋白质。使用PSIPRED对Hdh-MMP-16二级结构进行预测，结果表明，α-螺旋结构占15.4%，β-折叠占6.0%，无规则卷曲占78.6%。

预测Hdh-MMP-17蛋白质相对分子质量为73.15 ku，理论等电点为8.60。基因编码的636个氨基酸中，带有正电荷的碱性氨基酸精氨酸(Arg)和赖氨酸(Lys)共80个，带有负电荷的酸性氨基酸天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)共72个。该蛋白质的不稳定系数和疏水值分别为40.02和-0.367，是一种不稳定的亲水性蛋白质。二级结构预测结果表明，Hdh-MMP-17蛋白质中，α-螺旋结构占19.5%，β-折叠占12.7%，无规则卷曲占67.8%。

预测Hdh-MMP-21蛋白质相对分子质量为82.36 ku，理论等电点为8.55。基因编码的703个氨基酸中，带有正电荷的碱性氨基酸精氨酸(Arg)和赖氨酸(Lys)共108个，带有负电荷的酸性氨基酸天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)共101个。该蛋白质的不稳定系数和疏水值分别为 42.76 和-0.839，是一种不稳定的亲水性蛋白质。Hdh-MMP-21蛋白质二级结构组成为：α-螺旋结构占14.8%，延伸链占12.5%，无规则卷曲占72.7%。

2.3 Hdh-MMPs氨基酸序列比对及序列相似性分析

通过NCBI在线BLAST工具进行Hdh-MMP氨基酸序列相似性搜索，结果表明，Hdh-MMP-16/17/21序列与多种物种的MMP-16/17/21具有序列相似性，表明MMP在不同物种间较保守。进而利用DNAMAN软件对不同物种MMP-16/17/21氨基酸序列进行比对，结果显示，Hdh-MMP-16 氨基酸序列与缅甸蟒蛇(Pythonbivittatus，XP_015745754.1)、红头美洲鹫(Cathartesaura，KFP55131.1)和白尾海雕(Haliaeetusalbicilla，XP_009910615.1)MMP-16的同源性分别为32%、32%和31%(见图2a)；Hdh-MMP-17 的氨基酸序列与太平洋牡蛎(Crassostreagigas，EKC39793.1)、双胸斑沙鸟(Charadriusvociferus，XP_009886438.1)和波斑鸨(Chlamydotismacqueenii，KFP39531.1)MMP-17的序列相似性分别为43%、33%和33%(见图2b)；Hdh-MMP-21氨基酸序列与光滑双脐螺(Biomphalariaglabrata，XP_013079423.1)、虾夷盘扇贝(Mizuhopectenyessoensis，OWF51000.1)和美洲牡蛎(Crassostreavirginica，XP_022341852.1)MMP-21的序列相似性分别为47%、43%和46%(见图2c)。

2.4 Hdh-MMPs基因在皱纹盘鲍不同组织中的相对表达量分析

qPCR是一种在DNA扩增反应中以荧光化学物质监测每次PCR循环后产物总量的方法，可通过内参或外参法定量分析样品中的特定DNA序列。本研究利用qPCR检测Hdh-MMPs基因在皱纹盘鲍不同组织中表达量差异，探究MMPs在皱纹盘鲍体内的组织分布情况。结果显示，Hdh-MMP-16/17/21基因在检测的不同组织均有不同程度的表达。其中，Hdh-MMP-16在血淋巴细胞中表达量最高，其次为肝胰腺和外套膜，在其他组织中表达水平较低(见图3a)。Hdh-MMP-17在血淋巴细胞中表达量最高，其次为鳃、腹足、性腺和外套膜，肝胰腺和肌肉中表达量较低(见图3b)。Hdh-MMP-21在鳃中表达量最高，其次为性腺和肌肉，在其他组织中表达量较低(图3c)。

2.5 Hdh-MMPs在皱纹盘鲍感染弧菌前后表达量差异的分析

近年来研究表明，MMP参与调控机体抗菌和抗病毒先天性免疫反应。本研究中，将副溶血弧菌以肌肉注射的方式感染鲍鱼，并检测感染不同时间后鲍鱼主要免疫器官肝胰腺、鳃、血淋巴细胞中Hdh-MMPs基因相对表达量变化情况，如图4a～图4c所示。可见，与PBS组对比，副溶血弧菌感染后鳃中Hdh-MMP-16表达量整体呈现上升的趋势，而在血淋巴细胞和肝胰腺中则与对照组接近。Hdh-MMP-17相对表达量在弧菌感染后呈现先上升后下降的趋势。在肝胰腺和鳃中，Hdh-MMP-17相对表达量在注射后12 h达到最高值；而在血淋巴细胞中，在注射后48 h达到最高值(图4d～图4f)。弧菌感染后，鳃和肝胰腺中的Hdh-MMP-21基因一定程度上调表达，而血淋巴细胞中该基因表达水平与对照组无异(图4g～图4i)。综上所述，Hdh-MMP-16/17/21可能与鲍鱼抵御病原菌入侵的先天免疫性调控相关。

3 讨论

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一类锌离子依赖型内肽酶，它是降解ECM的主要酶类，能够参与生物体多种生理和病理过程[11-12]。截至目前，已发现了至少26种结构与功能各异的MMP，根据其细胞亚定位可分为分泌型MMPs和膜型MMPs(membrane-type MMPs，MT-MMPs)。新合成的MMP以酶原的形式存在，当其前肽区被剪切后，酶原得以活化。而后，基质金属蛋白酶的内源性抑制剂金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMP)结合在活化的MMP的活性位点，从而影响其酶活性[13]。在前期研究中，本课题组已从鲤鱼(Cyprinuscarpio)和刺参(Stichopusjaponicus)中克隆得到MMP-2基因全长序列，通过异源表达得到具有活性的MMP-2催化结构域，并探索了MMP-2降解胶原蛋白的特性[14-15]；从皱纹盘鲍中克隆得到MMP-1基因全长序列，但是并未获得具有酶解活性的MMP-1蛋白质[16]。已有研究报道，哺乳动物中多种MMP(如MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-7，MMP-9，MMP-17和MMP-25等)可以直接或间接影响机体内参与炎症反应和组织修复的细胞因子与趋化因子的活性，其中MMP-7能直接杀死入侵的病原菌[17-18]。此外，巨噬细胞分泌的MMP-12能被运输到感染了病毒的宿主细胞内，进而转运到细胞核内，作为一个转录因子起始NFKBIA 基因的转录，最终导致IFN-α的大量分泌并发挥保护宿主的作用[9]。因此，除了参与胞外基质的降解，MMP在机体的炎症反应和先天性免疫反应中也发挥重要作用。本研究克隆得到皱纹盘鲍3个MMPs基因(Hdh-MMP-16/17/21)部分序列，序列分析结果表明，该3个基因编码的蛋白质含有MMP典型的催化结构域和类血红素结合区。催化活性中心HEXGHXXGXXH 3个组氨酸残基(H)与Zn2+形成的配位键是MMP发挥生物学活性的关键。多序列比对结果表明，Hdh-MMPs蛋白质与某些软体动物的MMPs具有序列相似性，而Hdh-MMP-17还和人MMP-17蛋白质具有较高的同源性，表明结构相似的MMPs在不同物种间较保守。

MMP-16(membrane-type 3 MMP，MT3-MMP)和MMP-17(membrane-type 4 MMP，MT4-MMP)属于膜型基质金属蛋白酶，可在细胞边缘降解ECM，从而参与调控细胞增殖、凋亡、分化和迁移等活性。MMP-16是I型跨膜基质金属蛋白酶，在正常的成纤维细胞中高度表达。它不仅可以降解Ⅲ型胶原蛋白、聚糖、明胶和纤连蛋白等，还可一定程度上激活MMP-2，随着蛋白酶原从细胞排出而进入其活性形式。MMP-16的活性受TIMP-2、TIMP-3和TIMP-4严格调控。有趣的是，在低浓度TIMP-2作用下，MMP-16激活MMP-2酶原的活性显著提高，这一作用可能与三元复合物的形成有关[19]。已有研究表明，MMP-16不仅参与晚期软骨细胞分化、椎间盘退变等过程[20-21]，同时也参与上皮-间质细胞转化和细胞迁移[22]。与MMP-16不同的是，MMP-17通过与糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)结合而锚定在细胞膜上，因此被称为GPI固定化蛋白，其活性主要受TIMP-1和TIMP-2调控[23]。MMP-17缺陷型小鼠并未呈现出明显的病态，说明MMP-17缺失不影响机体的正常发育和个体存活[24]。在软骨关节炎、乳腺癌和头颈癌等病人样品中MMP-17大量表达，表明MMP-17与疾病发生和发展相关[23]。脂多糖刺激之后，马氏珠母贝MMP-17基因表达水平在12 h后达到最大值，之后逐渐下降至正常水平[25]。本研究结果显示，Hdh-MMP-16在皱纹盘鲍血淋巴细胞和肝胰腺中表达量最高，而Hdh-MMP-17在血淋巴细胞和鳃中表达量最高。由于血淋巴细胞、鳃和肝胰腺是鲍鱼主要的免疫器官，Hdh-MMPs在这些组织中的高表达可能与皱纹盘鲍的先天免疫相关。致病菌感染机体后，皱纹盘鲍鳃组织中MMP-16转录水平显著上调，但血淋巴细胞和肝胰腺中MMP-16转录水平基本无变化。Hdh-MMP-17在血淋巴细胞、鳃和肝胰腺中表达量均一定程度上调。已有研究表明，副溶血弧菌主要侵染鲍鱼的血窦和鳃上皮细胞[26]。用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)标记的副溶血弧菌感染鲍鱼后，其主要粘附和进入鳃组织[27]。鲍鱼的肝胰腺也是非常重要的免疫器官，其分泌的多种蛋白酶可通过水解作用来抵御病原菌的侵染[28]。因此，弧菌感染鲍鱼后鳃组织中Hdh-MMP-16表达量的上调以及三个免疫器官中Hdh-MMP-17表达量的上调可能与宿主抗病原菌感染有关。

MMP-21属于转化酶激活的基质金属蛋白酶，在多种恶性肿瘤中高表达。与其他MMPs不同的是，MMP-21主要由上皮细胞和肿瘤细胞表达与分泌，表明MMP-21的主要作用是参与肿瘤的发生和转移[29]。本研究结果显示，Hdh-MMP-21在上皮细胞丰富的鳃组织中表达量最高，这与MMP-21的表达特性相一致。此外，利用反转录聚合酶链式反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)技术可以在几种正常的人体组织中检测到MMP-21的转录本，这些组织包括肾脏、胎盘、脑、肺和白细胞等，说明MMP-21可能在维持机体稳态和代谢过程中发挥一定作用[30]。已有研究显示，斑马鱼中MMP-21基因表达的抑制能显著影响斑马鱼心脏环化[31]。由于鲍鱼肌肉中富含胶原蛋白，其含量直接影响肌肉嫩度[32]。在本研究中，肌肉组织中表达量较高的MMP-21可能参与胶原蛋白的新陈代谢，进而影响鲍鱼肌肉质构。此外，副溶血弧菌感染12 h后，鳃和肝胰腺中Hdh-MMP-21表达量上调，说明其也可能参与皱纹盘鲍抗菌感染的早期阶段。

为了进一步探索Hdh-MMPs在皱纹盘鲍先天性免疫中的作用，下一步需体外表达Hdh-MMPs重组蛋白并制备特异性多克隆抗体，通过检测Hdh-MMPs在皱纹盘鲍不同组织和弧菌感染前后各组织蛋白水平的变化情况，进一步阐明Hdh-MMPs在鲍鱼体内的存在形式及其参与非特异免疫应答的机制。