HPLC-MS/MS检测非布索坦在大鼠血浆中的浓度及药动学研究

刘小雨，常鸿彦，朱雪粉，逯海燕，王迎春，刘爱明，徐玲玲，王 芳，戚 敏，王本伟,3

（1.山东省药学科学院 新药评价中心，山东 济南 250101；2.山东力诺制药有限公司，山东 济南 250101；3.山东安捷生物检测技术有限公司，山东 济南 250101）

非布索坦是一种新型的非嘌呤类选择性黄嘌呤氧化酶（XO）抑制剂，是目前广泛用于治疗伴有高尿酸血症痛风患者的新药。临床通常用于痛风治疗的别嘌醇只对XO的氧化形式有抑制作用，用于痛风治疗时需较大剂量维持血药浓度而导致药物蓄积和毒性[1-3]。非布索坦的作用不依赖于XO的氧化还原状态，不作用于嘌呤和嘧啶代谢途径中的相关酶，不影响嘌呤和嘧啶的正常代谢。临床研究显示，在各器官功能正常的患者中，非布索坦与别嘌呤相比，降低尿酸的作用更持久，安全性和有效性更好[4-7]。目前关于非布索坦的开发研究较多，建立一种简单、可靠、重现性好的浓度检测方法对其非临床药动学研究、毒动学研究具有重要的指导意义。

1 仪器与材料

1.1 仪器

AB SCIEX ExionLC-Triple Quad 4500液相质谱联用系统（美国SCIEX公司），包括工作站控制系统，脱气机，ExionLC AC二元高压泵，ExionLC AD Multiplate自动进样器，ExionLC AC柱温箱，Triple Quad 4500系统及Analyst 1.6.3数据采集软件；Z216MK高速冷冻离心机（德国Hermle）；Advantage A10 Milli-Q超纯水机（德国Merck）；Vortex Genius 3涡旋仪（德国IKA）。

1.2 材料

非布索坦（批号：20170910，纯度99.6 %，山东省药学科学院）；地西泮（批号：171225-201304，纯度99.9 %，中国食品药品检定研究院）；乙腈（色谱级，Fisher Chemical）；甲酸（色谱级，Fisher Chemical）；超纯水。

1.3 实验动物

SD大鼠，雄性，18只，体重230～260 g，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，在温度25 ℃、湿度60 %±5 %条件下饲养一周。随机分为3组，每组6只，分别灌胃给药2，5，10 mg/kg的非布索坦。于药前0 h，药后5 min，15 min，30 min，1 h，2 h，4 h，6 h，8 h，24 h，48 h颈静脉取血0.2 ml，置1.5 ml涂肝素钠的尖底离心管中，4 ℃、4000 r/min离心10 min，取上层血浆，-80 ℃冰箱中保存备用。

2 方法与结果

2.1 HPLC-MS/MS条件

色谱柱：Thermo Accucore C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，2.6 μm）。色谱条件：流动相为0.1 %甲酸-水（A）与乙腈（B）；洗脱梯度：0～0.8 min，10 %～95 % B；0.8～2.0 min，95 % B；2.01～3.0 min，10 % B；分析时间3 min。流速：0.55 ml/min；进样量：2 μl；柱温：45 ℃。

质谱条件：离子化方式：电喷雾-正离子；气帘气：35 psi；离子化温度：500 ℃；离子化电压：5000 V；雾化气：50 psi；辅助加热气：55 psi。监测方式：多反应监测（MRM）模式。非布索坦定量离子对为 [M+H]+m/z317.1/261.1，去簇电压90 V，碰撞能量55 eV；内标地西泮定量离子对为[M+H]+m/z285.1/193.1，去簇电压150 V，碰撞能量35 eV。

2.2 样本处理

从-80 ℃冰箱取出血浆样本，室温解冻，取20 μl，置于1.5 ml离心管中，加入180 μl乙腈（含内标地西泮20 ng/ml），涡旋混匀2 min，8 ℃下、13 000 r/min离心5 min，取上清，进样检测。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性 取空白血浆20 μl，加入180 μl乙腈，按2.2项下方法操作，得空白质谱图（见图1A）。取空白血浆20 μl，按2.2项下方法操作，得内标质谱图（见图1B）。取16 μl/ml非布索坦标准液5 μl，加空白血浆95 μl，涡旋后取20 μl，加入180 μl乙腈，按2.2项下方法操作，得非布索坦质谱图（见图1C）。取给药后0.5 h的血浆样品20 μl，按2.2项下方法操作，得血浆样品质谱图（见图1D）。非布索坦和内标的保留时间分别为1.44 min和1.37 min，内源性物质和内标均不干扰待测物的准确定量。

2.3.2 标准曲线 分别取0.2，0.5，2，5，20，50，100，200 μg/ml的非布索坦标准溶液5 μl，加入空白血浆95 μl，涡旋得10，25，100，250，1000，2500，5000，10 000 ng/ml的血浆标准样本，按2.2项下方法操作处理。以非布索坦的浓度为横坐标x，非布索坦与内标物的峰面积比值为纵坐标y，用加权最小二乘法（权重为1/x2）进行回归运算，求得的直线方程即为标准曲线。回归方程为y=0.000312x+0.00176，r=0.9978。表明非布索坦在10～10 000 ng/ml范围内线性关系良好。

2.3.3 准确度和精密度 分别取0.2，0.6，16，160 μg/ml的非布索坦标准溶液10 μl，加空白血浆190 μl，涡旋得10，30，800，8000 ng/ml 4个浓度的血浆标准样本，按2.2项下方法操作，每一浓度6个平行样本，以标准曲线计算得非布索坦的浓度，并计算其批内准确度和精密度。连续处理3个分析批，计算非布索坦的批间准确度和精密度。批间和批内准确度（RE）在91.1 %～115.6 %范围内，精密度RSD小于16.7 %，均符合2015版药典对生物样本的检测要求。结果见表1。

2.3.4 回收率和基质效应

图1 非布索坦和内标的MRM质谱图

表1 非布索坦的批内和批间准确度与精密度

2.3.4.1 回收率 分别取低（30 ng/ml）、中（800 ng/ml）、高（8000 ng/ml）3个浓度的标准溶液20µl，加180 ng/ml的内标溶液20 µl，再加入空白基质提取液160 µl，涡旋混匀后检测，每一浓度6个平行样本，峰面积记为Set1；分别取0.6，16、160µg/ml的非布索坦标准溶液10 µl，加空白血浆190µl，涡旋得低（30 ng/ml）、中（800 ng/ml）、高（8000 ng/ml）3个浓度的血浆标准样本，按2.2项下方法操作，进样分析，每一浓度6个平行样本，峰面积记为Set2。以Set2/Set1计算回收率。

2.3.4.2 基质效应 分别取低（30 ng/ml）、中（800 ng/ml）、高（8000 ng/ml）3个浓度的标准溶液20 µl，按2.2项下方法操作，进样分析，每一浓度6个平行样本；峰面积记为Set3。以Set1/Set3计算基质效应。回收率和基质效应结果见表2。结果表明，非布索坦在各浓度下提取回收率一致，基质因子符合要求。

表2 非布索坦和内标的回收率和基质效应（n=6）

2.3.5 稳定性考察 分别取0.6，160 µg/ml的非布索坦标准溶液10 µl，加空白血浆190 µl，涡旋得低（30 ng/ml）、高（8000 ng/ml）两个浓度的血浆标准样本，每一浓度6个平行样本，分别考察冻融循环稳定性（-80 ℃和室温冻融循环3次）、室温短期6 h稳定性、长期30 d稳定性（-80 ℃长期存放）和样品制备后24 h自动进样器稳定性（15 ℃）。结果见表3。

表3 非布索坦的稳定性（n=6）

2.3.6 稀释效应 制备20 µg/ml的血浆样本，用空白血浆稀释5倍，然后取20 µl，按2.2项下方法操作，平行测定6个样本，结果准确度（RE）均值为88.6 %，精密度RSD为4.6 %。说明高浓度血浆样本经过5倍稀释后不影响待测物准确定量。

2.3.7 残留 取空白血浆20 µl，按2.2项下方法操作制备得到残留样本，在标准曲线最高点样本后进样残留样本，结果表明残留样本峰面积小于定量下限峰面积的20 %，符合要求。

2.4 药动学结果

取-80 ℃冷冻大鼠血浆样本，室温解冻，取20µl，置于1.5 ml离心管中，按2.2 项下方法操作，依随行标准曲线计算血浆样本的浓度。Phoenix 8.1计算药动学参数。SD大鼠灌胃给药2，5，10 mg/kg的非布索坦后，Cmax分别为1603.0，3470.2，7695.0 ng/ml，比值为1:2.2:4.8；AUC0-48h分别为10 186.1，22 427.5，65 671.5 h·ng/ml，比值为1:2.2:6.4。非布索坦在大鼠体内的达峰浓度和暴露量随剂量升高基本成比例增加。平均血药浓度-时间曲线见图2，主要药动学结果见表4。

表4 非布索坦药动学参数

图2 灌胃给药后非布索坦的药-时曲线

3 讨论

3.1 色谱条件的优化

本研究分别考察了不同的流动相及色谱柱，最后流动相选择0.1 %甲酸-水和乙腈，此条件下峰形较好，出峰时间适中，内源性物质不干扰分析物的准确定量；色谱柱选择Thermo Accucore C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，2.6 μm），该色谱柱具有柱效高，柱压低，分析时间短等优势。

3.2 样本处理

血浆样本处理采用乙腈沉淀蛋白法，方法简便，操作简易，能达到较高的响应且不具有基质效应，能满足高通量分析要求。血浆样本用量少，灵敏度高。

3.3 采样时间优化

SD大鼠灌胃给予非布索坦后，在体内的血药浓度-时间曲线中，3～4个时间点分布在吸收相，4～5个以上时间点分布在消除相，AUC0-48h/AUC0-∞均大于99.0 %，说明采集时间点选择较合理。

3.4 非布索坦药动学特征

非布索坦灌胃给予大鼠后达峰时间为1.3～2.0 h，半衰期为5.7～7.8 h，吸收较快，消除较慢。文献报道的人体中达峰时间为0.5～1.3 h[8]，半衰期为9.4 h[9]。本实验结果显示，非布索坦具有良好的药动学特征，可避免临床患者频繁服药引起不适。

本研究基于HPLC-MS/MS技术，建立了非布索坦在大鼠血浆中浓度的检测方法，并对其进行了方法学验证。结果表明，该方法能快速准确地检测血药浓度，且血浆用量少，灵敏度高，重现性好，可用于非布索坦药动学研究。