酶联免疫吸附法测定家禽配合饲料中氯霉素含量结果探析

刘宏梅 韦文飞 农爱红 卢少坤 陆必科

（百色市动物疫病预防控制中心，广西 百色市 533000）

氯霉素（Chloroamphenicol，CAP）是一种广谱抗生素[1]，随着家禽养殖业的集约化与规模化发展，家禽的疾病更加频繁发生，氯霉素以它对多种病原菌有较强的抑制作用和低廉的价格,而曾被广泛应用于动物生产[2]。但由于氯霉素存在严重的副作用，残留的氯霉素通过食物链进入人体后，对人体构成长期、慢性和积累性的潜在危害，并诱发致病菌的耐药性。能引起造血系统严重不良反应,主要是抑制骨髓造血机能[3]，对人类健康造成极大威胁，欧美等发达国家已相继禁止或严格禁止使用，我国也明确规定在动物源性食品中不得检出氯霉素。由于经济利益的驱使，加之检测难度大，氯霉素在畜牧业中的使用仍未能得到有效控制和禁止，药物残留依然日益突显。所以选择一种高效、便捷、实用的快速检测方法成为业内人士亟待的目标。传统上常用高效液相色谱法，但其紫外检测器在纳克级缺乏敏感性；气相色谱法灵敏度高，检测限低，但它检测样本少，很难用于大规模检测，无法满足实际工作需要；液质联用法与气质联用法可同时定性和定量，但对仪器、人员素质要求高，样品前处理繁琐、耗时，也不适宜大规模应用。酶联免疫吸附法以其检测速度快、费用低廉、灵敏度高和选择性强、操作简便、试验过程短、检测样品多、特异性高等特点被广泛应用于免疫学检验的各个领域中[4]。ELISA试剂盒试剂稳定、容易保存、操作简便，不需要精密复杂设备，对环境无污染等特点而被用于兽药残留检测领域中。本试验通过对氯霉素标准溶液添加量及回收率的检测以判断该方法能满足检测饲料中氯霉素残留的需要。

1 材料与方法

1.1 试验试剂与样品

氯霉素残留酶联免疫检测试剂盒（北京望尔生物技术有限公司批号C190113A10GGX），乙酸乙酯、正己烷，试验中所使用的试剂，除特别注明外均为分析纯。实验用水符合实验室用水规则（GB/T6682）。试验样品为2019年百色市饲料和饲料添加剂产品质量安全监测中所抽的饲料样品。

1.2 仪器设备

雷杜RT−6100型酶标仪，氮吹仪，振荡器，离心机，天平（感量0.01g）,微量移液器（单道20～200μL，多道50～300μL，容量瓶，聚苯乙烯离心管。

1.3 样品的制备

取粉碎并过40目铜筛的饲料样本，作为供试样品；以粉碎并过40目铜筛的空白样本，作为空白对照。取粉碎并过40目铜筛的空白样本，添加适宜浓度的对照溶液，作为空白添加试样。

称取1.0±0.05g试样，加入6mL乙酸乙酯，充分振荡5min，3000g以上离心5 min；移取3mL上层有机相至10mL洁净干燥玻璃管中，50℃水浴氮气流下吹干；加入1mL正己烷，涡旋1min，再加入1mL复溶工作液涡旋30s，3000g以上离心5min；除去上层有机相，取下层水相50μL用于分析。

1.4 氯霉素含量的检测与检测方法准确度测定

分别准确称取8份重量为1.0g空白试料，分别加入8个10mL聚四氟乙烯离心管中，均分为4组，每组2个重复。每组分别加入0μL、10μL、30μL、50μL的氯霉素标准溶液（10霉素标准），分别配制成0μg/kg（空白平行对照）、0.1μg/kg、0.3μg/kg、0.5μg/kg平行样本。按试剂盒使用说明书进行严格规范操作。

1.5 氯霉素标准曲线的测定

采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔上包被偶联抗原，加入一定体积标准品或样品中残留的氯霉素和酶标板微孔条上预包被的偶联抗原竞争氯霉素酶结合物，用TMB底物显色，标准品或样品的吸光度值与其所含残留物氯霉素的含量成负相关。具体操作严格按试剂盒使用说明书进行规范操作。

2 结果与分析

2.1 氯霉素标准曲线的测定分析

测出相应吸光度值后，分别以0ppb、0.025ppb、0.075ppb、0.3ppb、1.2ppb、4.8ppb氯霉素标准对照品的百分吸光率为纵坐标，以氯霉素各标准品浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准曲线图,其标准曲线方程为：Y=−0.2394X+1.0668，相关系数为0.9910，具体标准曲线图如图1所示。

2.2 氯霉素添加回收试验结果

图1 氯霉素的标准曲线

将测得的样品百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样品所对应的浓度，乘以其所对应的稀释倍数即为样品中氯霉素的实际浓度。添加回收试验结果为：0.1μg/kg添加OD值分别为1.398、1.396，实测浓度为0.104、0.105；0.3μg/kg添加OD值分别为0.912、0.910，实测浓度为0.306、0.308；0.5μg/kg添加OD值分别为0.688、0.686，实测浓度为0.502、0.504。添加平衡回收率分别为105.0%、102.0%、100.6%，变异系数分别为 0.48%、0.33%、0.20%，具体添加回收试验结果如表1所示。由试验结果可知本方法在 0.1μg/kg、0.3μg/kg、0.5μg/kg添加浓度的回收率为70%～120%以内，批内变异系数≤5%，具有较高的准确度和灵敏度。

3 讨论与分析

由试验结果可知，本方法具有较高的准确度和灵敏度，满足饲料中氯霉素残留的检测需要。

ELISA方法为目前国内最常用的抗生素残留检测方法之一[5]，具有灵敏度高，特异性强，重复性好，可进行定量及半定量测定的优点，但该方法受反应时间、反应温度、洗涤彻底性等因素影响，操作步骤较多，要求操作熟练，否则易出现假阳性和不易定量，需要色谱法进一步定量和确证。

在使用前，所有试剂应恢复到室温并摇匀，以保证试剂的均一性。加样时要垂直加到孔底，不能有气泡；整个加样过程要迅速，以保证各加样孔反应时间相对一致。

洗板时一定要迅速，保证每个孔放置时间一致。加洗涤液时不可溢出，以免造成交叉污染。洗涤后甩掉液体、拍干，洗板次数、洗液量的多少、浸泡时间的长短、洗板的力度等都可能会造成跳孔或出现背景高。

在加入终止液后要在最短的时间内上机检测，否则吸光度会随着时间的延长而受各种环境因素的影响发生变化，造成测试结果不准确。

鉴于ELISA方法具有简便、省时、省力的优点，建议在日常兽药残留监控工作中，可以先用ELISA方法进行初筛，再对筛选出的阳性样品用精确方法验证，可大大降低检测成本，有效防止漏检和错判，提高工作效率。

本试验验证了ELISA法测定家禽饲料中氯霉素含量的可行性，证实该方法简便快捷、重复性好，回收率和检出限令人满意，从而为今后饲料中氯霉素残留检测提供技术参考。

表1 添加回收试验结果