大豆萌发期脂肪氧化酶与脲酶活性变化及钝化方法效果评价

邢竺静，李笑梅，赵廉诚，石彦国，王如梦，闫怡宏，张娜

（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江哈尔滨150076）

众所周知，大豆中含有丰富的蛋白质（40%～50%），油脂（20%左右）以及多种对人体有益的活性物质[1-2]。但是，也含有一些抗营养因子（antinutritional factors，ANFs）：脂肪氧化酶（lipoxygenase，Lox）、脲酶、胰蛋白酶抑制剂、植酸等[3-5]。这些抗营养因子的存在不仅使大豆制品的品质下降，而且会影响其制品的风味和机体对营养素吸收和利用[6]。而且Lox 氧化能力较强，可氧化大豆中的多种维生素，从而降低维生素有效性[7-10]。此外，Lox 可以催化大豆及其制品中的不饱和脂肪酸的氧化，产生醛、醇等物质，并产生豆腥味[11]；脲酶遇水可迅速将含氮物质分解成氨，大量氨的存在会引起机体氨代谢障碍，使人中毒[12-13]。大豆及其制品中两种酶的活性高低影响到产品品质，因此关于抗营养因子的钝化便一直受到关注。

目前，抗营养因子的钝化主要包括物理方法、化学方法、生物方法[13-15]。物理方法有微波辐射、烘烤、蒸煮、漂烫等，其应用最为广泛，成本较低，且处理后的原料可以加工多种类型的产品；化学方法有pH 值处理、尿素处理、乙醇处理、亚硫酸钠处理、偏重亚硫酸钠处理等通过改变分子结构[13]的方式，但容易造成化学残留，产生污染环境；生物方法常用的是发酵、酶制剂处理[16]，虽然安全但成本较高、而且后续只能用于加工发酵类型的制品；还有利用种子萌发的方法使抗营养因子含量下降，其优点是自然安全，可用于制备豆浆、发芽饮料等萌动食品。因此，物理与萌发方法优势突出，近几年在大豆发芽后的抗营养因子的钝化作用有较多研究，但是在萌发即未发芽阶段的研究仍鲜有报道。

本试验以两个品种大豆为原料，探讨了大豆在萌发期Lox、脲酶活性变化，再进一步以萌发豆为研究对象，在比较微波辐射、烘烤、漂烫钝化方法效果基础上，选择适宜的方法并进行参数确定，并对Lox 酶促反应产物醛醇类物质进行定性定量分析，评价钝化效果。研究旨在达到最大限度降低萌发大豆及豆浆因抗营养因子及Lox 导致的豆腥味问题，为萌发大豆产品的发展提供技术支持；为大豆综合加工利用，加强大豆产品的深加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑农71：黑龙江省农科院大豆所；黑科56：黑龙江省农科院黑河分院。

尿素：天津硕海化工有限公司；磷酸氢二钠、磷酸氢二钾：无锡市晶科化工有限公司；硼砂、硼酸：济宁辉鹏化工有限公司；亚油酸：江西贝尔高科新材料有限公司；亚油酸：上海阿拉丁生化科技有限公司，均为分析纯；2-甲基-3-庚酮：美国Sigma 公司。

1.2 仪器与设备

Alpha-1506 紫外可见分光光度：上海谱元仪器有限公司；TG16-WS 台式高速离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；DHG-9203AD 电热恒温干燥箱：郑州南北仪器设备有限公司；P70F23P-G5 微波炉：广东格兰仕集团有限公司；Agilent5973 气质联用仪：安捷伦科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆萌发

将两个品种大豆以豆水比1 ∶5（g/mL）进行浸泡萌发，在 25 ℃下，分别萌发 4、8、12、16、20 h（当萌发时间超过20 h 时，大豆开始发芽，为发芽大豆），然后将大豆沥水，放入45 ℃恒温干燥箱内干燥，制成粉状样品，分别测定脲酶和Lox 活性，评价抗营养因子的变化，选择活性最低的萌发条件得到的萌发大豆作为钝化处理的样品。

1.3.2 脲酶活性测定

参照GB/T 8622-2006《饲料用大豆制品中尿素酶活性的测定》[17]执行。

结果计算：脲酶活性X，单位为U/g，按公式（1）计算。

式中：X 表示试样的脲酶活性，U/g；c 表示氢氧化钠标准滴定溶液浓度，mol/L；V0表示空白消耗氢氧化钠标准滴定溶液体积，mL；V 表示试样消耗氢氧化钠标准滴定溶液体积，mL；14 表示氮的摩尔质量，M（N2）=14 g/mol；30 表示反应时间，min；M 表示试样质量，g。

1.3.3 Lox 活性测定

采用亚油酸-吐温60 紫外分光光度计方法[18]进行测定：取大豆粉用0.015 mol/L，pH 8.2 的Tris-HCl 缓冲液离心（4 000 r/min）5 min，取上清液 0.2 mL 和亚油酸吐温60 制成的底物2.8 mL 于石英比色皿内，混合均匀，在234 nm 处记录OD 值变化，每15 秒记录一个数据。计算公式见公式（2）。

式中：Λ 表示酶的活性单位；OD 表示30 s 及15 s时的OD 值；0.01 表示一个常数，即每分钟增加0.01 吸光度所需的活性作为大豆Lox 的一个活性单位。

1.4 钝化抗营养因子方法的筛选

分别选择了烘烤、微波和沸水漂烫3 种方法处理萌发大豆，测定脲酶和Lox 活性，选择能使脲酶和Lox活性降低幅度大的处理方法，同时以未处理且在适宜浸泡条件下萌发大豆为对照。

1.4.1 烘烤处理

将50 g 萌发大豆散开平铺放入150 ℃烘箱内，烘烤8 min，45 ℃烘干，测定脲酶和Lox 活性。

1.4.2 微波处理

将50 g 萌发大豆散开平铺于微波玻璃盘中，中火（385 W）微波处理30 s，45 ℃烘干，测定脲酶和Lox活性。

1.4.3 漂烫处理

将50 g 萌发大豆放入沸水中漂烫30 s，45 ℃烘干，测定脲酶和Lox 活性。

1.5 钝化抗营养因子条件确定

将50 g 萌发大豆进行沸水漂烫，考察不同漂烫时间 10、20、30、40、50、60、70 s 对脲酶和 Lox 活性的影响，确定适宜漂烫时间。

1.6 豆腥味物质含量测定

采用顶空固相微萃取与气相色谱-质谱联用（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography－mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS） 结合的方法[19-20]略有改动，进行测定。

HS-SPME 条件：在20 mL 萃取瓶中放入转子，加入5 g 样品迅速旋紧盖子，用微量进样器穿透瓶塞加入 10 μL 的内标物（2-甲基-3-庚酮 100 mg/kg），使用DVB/CAR/PDMS-50/30 μm 萃取头，萃取温度 40 ℃，顶空吸附30 min。

GC-MS 条件：选用DB-WAX 色谱柱；进样口温度250 ℃；升温程序：40 ℃保持 8 min，然后以 4 ℃/min 升温至 150 ℃，再以 20 ℃/min 升温至 250 ℃，保持 5 min，不分流进样；载气：99.999 %高纯度氮气；载气流速：1 mL/min。离子源：EI 源；电子能量：70 eV；接口温度：280 ℃；扫描范围（m/z）：30～500；采集方式：Scan。

1.7 Lox活性与两种萌发大豆豆腥味物质含量的相关性分析

采集试验中Lox 活性与两种萌发大豆豆腥味物质含量的数据，利用SPSS 23.0 进行相关性分析，得到Lox活性与两种萌发大豆豆腥味物质含量的相关系数。

1.8 数据处理

试验取3 次平行测得平均值，均以mean±sd 表示。采用Origin、SPSS Statistics 23.0 软件对数据进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 萌发时间对脲酶的影响

萌发时间对脲酶活性的影响见图1。

图1 萌发时间对脲酶活性的影响Fig.1 Effect of germination time on urease activity

由图1 可知，两种品种大豆在萌发时间＜4 h 时，脲酶活性显著下降（P＜0.05），当萌发时间超过 4 h 时，脲酶活性下降幅度平缓且无显著差异（P＞0.05）；黑科56在萌发 16 h～20 h 时，脲酶的活性下降显著（P＜0.05）。

这是由于大豆在萌发过程中，大豆中抑制脲酶活性的因子在在厌氧的环境下未与空气接触，未氧化[21]造成组织结构破坏[22]。当萌发时间超过4 h 时，大豆中脲酶活性抑制因子已经全部与脲酶接触，因此，脲酶的活性在4 h 后趋于稳定。

2.2 萌发时间对Lox的影响

萌发时间对Lox 活性的影响见图2。由图2 可知，两个品种大豆在萌发0～20 h 时，Lox 的活性显著呈现显著下降的趋势（P＜0.05）。官品质。Skrzypczak 等[23]发现发芽24 h 后大豆中Lox的活力明显减弱；Paucar[24]、Bordingnon[25]也得到了相似的结果。综合两种品种的大豆在萌发过程中脲酶与Lox 活性的变化，选取萌发时间20 h 为两种大豆的萌发时间。

图2 萌发时间对Lox 活性的影响Fig.2 Effect of germination time on lipoxygenase activity

2.3 钝化抗营养因子方法及参数的确定

2.3.1 钝化抗营养因子方法的筛选结果

3 种不同钝化方法对两种萌发大豆脲酶活性影响见图3。

图3 不同钝化方法对两种萌发大豆脲酶活性影响Fig.3 Effects of different passivation methods on urease activity of two germinated soybeans

由图3 可知，沸水漂烫钝化的方式较未处理的样品相比，脲酶活性出现极显著下降的情况（P＜0.01），烘烤与微波钝化的方式处理的两种萌发大豆脲酶活性显著低于较未处理的样品（P＜0.05）。经过沸水漂烫后，黑科56 与黑农71 的脲酶活性分别降到1.94 U/g 和1.78 U/g。

因此，采用沸水漂烫对两个品种的萌发大豆进行钝化处理效果最佳。

3 种不同钝化方法对两种萌发大豆Lox 活性影响见图4。

图4 不同钝化方法对两种萌发大豆Lox 活性影响Fig.4 Effects of different passivation methods on lipoxygenase activity of two germinated soybeans

由图4 可知，用相同方法处理两个品种时，对Lox活性的影响趋势相似，与未处理的样品相比，沸水漂烫、烘烤、微波处理后的样品，Lox 活性均显著下降（P＜0.05），经沸水漂烫处理后的Lox 活性较其他两种处理方法及未处理的样品显著下降（P＜0.05），且两个品种萌发大豆Lox 活性分别降到了13.40 U 和16.53 U。

综合可知，用相同方法处理两种品种时，对脲酶和Lox 活性的影响略有不同，对Lox 活性的钝化效果显著好于对脲酶活性的钝化效果（P＜0.05）。这是由于两种酶的蛋白结构不同，所以遇热变形失活程度不同。不同方法处理的两种大豆对两种酶的钝化效果均出现显著下降（P＜0.05），且均为沸水漂烫的钝化效果最佳。3 种钝化方法的机理不同，烘烤是利用高温空气为介质作用于大豆，微波是通过微波炉内产生的电磁波作用于大豆，漂烫是利用热水为介质作用于大豆。在3 种钝化方法中，沸水漂烫的钝化效果最明显，微波钝化效果其次，烘烤钝化效果最差。因此适宜的钝化方式为沸水漂烫处理。

2.3.2 沸水漂烫时间对抗营养因子的影响

沸水漂烫不同时间对两种酶的影响结果见图5、图6。

图5 沸水漂烫不同时间对黑科56 两种酶活性影响Fig.5 Effect of boiling water blanching on the activities of two enzymes in Hei Ke56

图6 漂烫不同时间对黑农71 两种酶活性影响Fig.6 Effect of boiling water blanching on the activities of two enzymes in Hei Nong71

由图5、图6 可知，随着沸水漂烫时间的增加，两个品种萌发大豆的Lox 与脲酶活性呈下降趋势。当沸水漂烫时间在0～40 s 时，Lox 与脲酶活性均出现显著下降（P＜0.05），在 40 s～70 s 中，两种酶的活性无显著变化（P＞0.05）。

这是由于Lox 的稳定温度在20 ℃～30 ℃，在沸水状态下，漂烫时间的增加可以使酶蛋白逐渐变性失活[26]，杜鹃[27]也证实，常压100 ℃热处理，可使大豆中的酶类蛋白失活。大量文献表明，90 ℃以上湿热漂烫可使Lox完全失活，可以在大豆萌发过程中便无Lox 产生豆腥味，脲酶也无法产生尿素使人体中毒[28]。

综上所述，黑科56 与黑农71 的最适沸水漂烫时间为40 s。

2.4 Lox活性与豆腥味物质含量的相关性分析

两种萌发大豆Lox 活性与豆腥味物质含量变化结果见图7、图8。

图7 黑科56 Lox 活性与豆腥味物质含量变化Fig.7 Changes of lipoxygenase activity and soybean flavor content in Hei Ke 56

图8 黑农71 Lox 活性与豆腥味物质含量变化Fig.8 Changes of lipoxygenase activity and soybean flavor content in Hei Nong71

Kumar.V[29]的研究结果表明，己醛、己醇和1-辛烯-3-醇是豆腥味的主要成分。由图7、8 可知，两个品种大豆中的豆腥味物质含量变化存在规律性变化，随着萌发时间的增加，己醛、己醇和1-辛烯-3-醇的含量下降，且经过沸水漂烫后的萌发大豆3 种物质含量均达到最低。

Lox 活性与两种萌发大豆豆腥味的相关性结果见表1。

表1 Lox 活性与两种萌发大豆豆腥味的相关性分析Table 1 Correlation analysis between lipoxygenase activity and flavor of two germinated soybeans

由表1 可知，在两种萌发大豆钝化试验中对Lox活性与豆腥味物质含量进行相关性分析，结果表明，己醛、己醇、1-辛烯-3-醇与Lox 活性的相关系数为分别为0.935、0.892、0.844，均呈极显著正相关。因此，一定程度上可以说明在两种萌发大豆的钝化试验中，豆腥味物质含量的变化与Lox 活性存在直接关联，也印证了Lox 活性的下降会有效地降低大豆豆腥味对大豆制品品质的影响。

3 结论

本试验为抑制大豆在萌发初期抗营养因子对大豆品质的影响，以黑科56、黑农71 两个品种大豆为原料，以脲酶活性、Lox 活性为指标，得出了适宜的萌发条件为25 ℃，20 h，此时与未萌发大豆相比，Lox 活性分别降低了38.27%、46.31%，脲酶活性分别降低了25.04%、16.46%。沸水漂烫、烘烤、微波3 种钝化方式中筛沸水漂烫为最适钝化方式，其工艺参数为沸水漂烫40 s，此时Lox 活性分别降低了89.19%、88.99%，脲酶活性分别降低了96.19%、97.30%。经相关性分析得出：两种萌发大豆的豆腥味物质含量与Lox 活性的变化呈极显著正相关（己醛、己醇、1-辛烯-3-醇与Lox活性的相关系数为分别为0.935、0.892、0.844）。此研究得到的试验数据可以为减少大豆制品中抗营养因子及豆腥味提供理论基础，为大豆萌发产品的发展提供了技术支持。