青蒿提取物对奶牛瘤胃体外发酵及甲烷生成的影响

苏汉书，熊本海，方洛云，蒋林树

(1.北京农学院动物科学技术学院/奶牛营养学北京市重点实验室，北京 102206；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193)

近年来，通过添加植物提取物在维持畜禽机体健康及调控其生产性能方面有着非常广阔的应用前景。而植物提取物如何调控反刍动物瘤胃发酵，已成为目前研究热点[1-3]。同时，反刍动物瘤胃内产生的甲烷不仅是一种温室气体，而且造成奶牛2%～5%的能量浪费[4]。现研究表明，单宁如儿茶素[5]、皂苷如茶皂素[6]、植物精油如月桂酸[7]等植物提取物均可作为瘤胃发酵调节剂和甲烷抑制剂，但在奶牛生产中普遍存在造价高、适口性不好等使用限制。故寻求可有效抑制奶牛甲烷排放和调节瘤胃发酵的绿色添加剂迫在眉睫。

青蒿提取物(Artemisinin)是由青蒿中提取出来的一种具有过氧基的新型倍半萜类化合物[8]，最早由中国科学工作者于20世纪70年代首次应用于治疗疟疾[9]，现在广泛应用于医药研究。至今，研究发现其具有抗疟[10-11]、抗菌[12-14]、解热[15]、增强免疫[16-17]、抗肿瘤[18]、抗寄生虫[19]、抗内毒素[20]等多种生物学作用。目前，青蒿提取物已作为绿色植物添加剂在畜牧生产中的应用取得显著进展。研究证明青蒿提取物可以显著提高动物生长性能[21]、抑制寄生虫繁殖[22]、增强机体免疫力[23]。利用体外产气法研究发现在维持瘤胃正常发酵的条件下，青蒿提取物可作为甲烷抑制剂。在青藏高原高寒草甸的枯草期时，牦牛的青蒿提取物适宜添加量为0.50%；返青期时牦牛适宜添加量为2.00%；青草期时牦牛适宜添加量为1.00%；枯黄期时牦牛适宜添加剂量为0.25%。其中返青期添加0.50%时抑制效果最佳[8]。而藏羊的四期牧草各适宜添加水平均为0.50%[24]。另添加5 g/kg青蒿提取物和70 g/kg大黄可以替代15 mg/kg莫能菌素来降低瘤胃发酵过程中甲烷的产量，作为改善山羊瘤胃发酵的绿色添加剂[25]。这说明青蒿提取物可以有效调控反刍动物瘤胃发酵及抑制甲烷排放。目前青蒿提取物对奶牛瘤胃发酵及甲烷排放的相关研究较少。

本试验通过瘤胃体外发酵试验，研究青蒿提取物对奶牛瘤胃发酵及甲烷生成的影响，旨在为今后青蒿提取物作为奶牛生产绿色饲料添加剂提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

青蒿提取物选购自陕西森弗天然制品有限公司，为棕黄色粉末。其含青蒿素39%，粗灰分25%，粗蛋白14%，多糖12.7%等。

1.2 瘤胃体外发酵试验设计及方法

1.2.1 瘤胃液采集 在北京奶牛中心延庆基地良种场选取4头体况相近、胎次相近的健康荷斯坦奶牛作为瘤胃液供体。于晨饲前通过口腔采液器进行瘤胃液采集，并转移至事先预热达39 ℃并充满CO2的保温瓶内。收集完毕后迅速带回实验室4层纱布过滤备用。

1.2.2 人工唾液盐和发酵底物配制 参照Menke等[26]的方法于试验前1 d配制人工唾液盐，各组分组成见表1。各溶液配制后依次加入蒸馏水、微量元素溶液、碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、刃天青指示剂和还原液。充分混匀后持续通入CO2，直至溶液颜色由粉红色变为无色透明，将pH调整至6.8，于39 ℃预热备用。

发酵底物：由玉米青贮、苜蓿、棉籽、干酒糟及其可溶物等65 ℃烘干48 h后，研磨过1 mm筛，按照底物比例混匀备用。发酵底物组成及营养水平见表2。

表1 人工唾液盐各组分组成Tab.1 Composition of different component of artificial saliva

表2 发酵底物组成及营养水平(干物质基础)Tab.2 Composition and nutrient levels of fermentation substrate ( DM basis)

注：每千克预混料中含有：Cu 800 mg，Mn 1 200 mg，Zn 3 300 mg，Se 30 mg，Co 20 mg，Fe 1 400 mg，I 70 mg，VA 1 100 000 IU，VD 330 000 IU，VE 3 000 IU；泌乳净能为计算值，泌乳净能=0.5501×消化能-0.0946[27]，其他营养水平为实测值。

Note: One kg of premix contained the following: Cu 800 mg, Mn 1 200 mg, Zn 3 300 mg, Se 30 mg, Co 20 mg, Fe 1 400 mg, I 70 mg, VA 1 100 000 IU, VD 330 000 IU, VE 3 000 IU; NEL was a calculated value, NEL=0.5501×DE-0.0946[27]; while other nutrient level were measured values.

1.2.3 体外发酵培养 采用单因素试验设计，准确称取500 mg发酵底物于150 mL体外发酵瓶中，分别添加0.00%(空白对照)、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、2.00%的青蒿提取物，共6个处理组，每组6个重复。接种时迅速将每个发酵瓶中加入25 mL瘤胃液和50 mL预热的人工唾液盐，持续通入CO25 s后，盖上瓶塞，立即将气袋与每个发酵瓶相连接，打开气袋阀门，置于恒温恒湿培养箱中39 ℃连续培养24 h，试验共重复3次。

1.2.4 样品采集及指标测定 发酵24 h后将发酵瓶置于冰水浴中，停止发酵，并立即关闭气袋阀门，取下气袋，检测产气量及甲烷。然后立即用便携式pH计(梅特勒-托利多Seven 2 Go)测定pH值。将发酵液用已知重量的孔径为37 μm、规格为15 cm×7 cm的尼龙袋过滤，滤渣用于检测瘤胃体外发酵干物质消失率；滤液分装于2只2 mL离心管和2只10 mL离心管中。2 mL离心管中的发酵液用于氨态氮(NH3-N)以及挥发性脂肪酸(VFA)的测定，10 mL离心管发酵液作为备样。

氨态氮质量浓度利用靛酚比色法[28]测定。2 mL样品于12 000×g离心20 min，取上清液40 μL至试管中；边混匀边加入2.5 mL苯酚显色剂、2.0 mL次氯酸盐试剂；置于37 ℃水浴中显色30 min，冷却后于550 nm下比色。

挥发性脂肪酸浓度采用内标法测定[29]。使用安捷伦7890B型号气相色谱仪测定。色谱条件：FID检测器，流速为30 mL/min的氮气作为载气，空气发生器提供流速为40 mL/min的氢气，空气流速400 mL/min，总流量54 mL/min，吹扫流量3 mL/min，分流比50∶1，线速度27.8 cm/s。DB-FFAP(15 m×0.32 mm×0.25 μm)填充柱，柱温180 ℃，检测温度280 ℃，进样口温度250 ℃，进样量2 μL。

干物质消失率采用尼龙袋法测定。将尼龙袋发酵液滤渣在65 ℃烘干4 h后称重。计算公式如下：干物质消失率=(滤渣加尼龙袋烘干后重-尼龙袋重)/发酵底物重×100%。

甲烷浓度由发酵24 h后气袋收集的气体经气相色谱仪(安捷伦7890B)测定[30]。色谱条件：TCD检测器，PorapakQ填充柱，流量为33 mL/min的氮气作为载气，进样口温度150 ℃，检测温度100 ℃，柱温30 ℃，柱流量1.6 mL/min，进样量1 mL。

运用气袋法计算总产气量。发酵24 h后，将发酵瓶连接的气袋关闭阀门，采用注射器抽取其中气体，读取体积，估算产气量。

发酵底物中粗蛋白含量参照GB/T 6433-2006测定、粗灰分含量参照GB/T 6438-2007测定、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量参照GB/T 6434-2006测定、钙含量参照GB/T 6436-2018测定、磷含量参照GB/T 6437-2018测定。

1.3 数据统计分析

试验数据经Excel 2016进行初步整理后，运用SPSS 20.0统计软件进行方差分析，组间采用Duncan法进行多重比较，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

统计分析模型：Y=μ+α+ε

式中：Y表示因变量值；μ表示总体平均值；α表示不同剂量的青蒿提取物处理效果；ε表示随机误差。

2 结果与分析

2.1 青蒿提取物对奶牛瘤胃pH、氨态氮、干物质消失率的影响

如表3所示，与对照组相比，添加青蒿提取物对奶牛瘤胃体外发酵液pH值影响不显著(P>0.05)。发酵液氨态氮范围在34.25～41.02 mg/dL之间，试验组与对照组相比差异显著(P<0.05)。且当添加0.50%的青蒿提取物时，氨态氮达到最高值41.02 mg/dL，显著高于对照组(P<0.05)。0.50%组、0.75%组与2.00%组的氨态氮差异显著(P<0.05)。与对照组相比，当添加0.50%和0.75%的青蒿提取物时，体外发酵的干物质消失率显著升高，且在0.75%组干物质消失率最高(P<0.01)。

2.2 青蒿提取物对奶牛瘤胃挥发性脂肪酸的影响

由表4可知，与对照组相比，添加不同剂量的青蒿提取物对总挥发酸、乙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸均无显著影响；与对照组相比，2.00%组显著降低丙酸含量，其余三组显著升高丙酸含量(P<0.05)，整体呈先升高再降低的趋势；对于乙酸/丙酸值，处理组均低于对照组，0.50%和0.75%组与对照组相比差异极显著(P<0.01)，且0.50%组的乙酸/丙酸值最低。

2.3 青蒿提取物对奶牛瘤胃产气量及甲烷浓度的影响

如表5所示，添加青蒿提取物对奶牛瘤胃体外发酵24 h产气量影响效果不显著。而与对照组相比，0.50%和1.00%组极显著降低24 h甲烷产量(P<0.01)，0.50%时抑制效果最佳且甲烷产量随添加剂量先减少后升高，在2.00%组时高于对照组。处理组发酵液中性洗涤纤维含量与对照组相比差异显著，0.50%和0.75%组显著低于对照组，1.00%和2.00%组显著高于对照组，组间差异显著，总体呈先降低后升高的趋势(P<0.05)。

表3 青蒿提取物对奶牛瘤胃发酵24 h后pH、氨态氮、干物质消失率的影响Tab.3 Effects of artemisinin on pH, NH3-N Concentration and Dry Matter Degradation Rate and in Dairy Cow Rumen for 24 h

注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同或无字母肩标表示差异不显著(P>0.05)。

Note:Values in the same row with different small letter superscripts mean significant difference(P<0.05)，while with the same or no letter superscripts mean no significant difference(P>0.05)

表4 青蒿提取物对奶牛瘤胃发酵24 h后挥发性脂肪酸的影响Tab.4 Effects of artemisinin onvolatile fatty acids in Dairy Cow Rumen for 24 h

注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同或无字母肩标表示差异不显著(P>0.05)。

Note: Values in the same row with different small letter superscripts mean significant difference(P<0.05)，while with the same or no letter superscripts mean no significant difference(P>0.05)

表5 青蒿提取物对奶牛瘤胃发酵24 h后产气量及甲烷浓度的影响Tab.5 Effects of artemisinin on gas production and CH4 Concentration in Dairy Cow Rumen for 24 h

注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同或无字母肩标表示差异不显著(P>0.05)。

Note: Values in the same row with different small letter superscripts mean significant difference(P<0.05)，while with the same or no letter superscripts mean no significant difference(P>0.05)

3 讨 论

奶牛瘤胃是一个复杂的大环境，维护瘤胃内环境稳定对奶牛营养生理至关重要。而pH值是反映瘤胃酸碱平衡和瘤胃微生物环境状态的重要指标，在一定程度上反映瘤胃消化代谢情况，其过高或过低均对瘤胃微生物的繁殖和发酵有不利影响。瘤胃内pH值受奶牛唾液分泌、瘤胃内有机酸积聚以及饲料精粗比的影响[31]。pH值正常范围在6.2～6.8之间，在本试验中，与对照组相比，添加不同剂量的青蒿提取物对奶牛瘤胃体外发酵液的pH值影响不显著，虽总体呈升高的趋势，但均在瘤胃pH正常值范围之内。氨态氮作为衡量瘤胃氮代谢的关键指标，是微生物合成菌体蛋白的前体物质。在本试验中，添加一定剂量的青蒿提取物能够显著提高氨态氮的质量浓度。瘤胃氨态氮质量浓度的最佳范围为6.58～36.7mg/dL[32]，Satter等[33]发现，体外条件下，保证瘤胃微生物最快生长的氨态氮质量浓度范围为20～50 mg/dL。当添加0.50%的青蒿提取物时，氨态氮质量浓度达到最高值41.02 mg/dL，效果最显著，虽略高于正常值，但仍在微生物正常生长范围之内。这与拜彬强等[24]研究结果一致。同时氨态氮取决于瘤胃微生物对饲料粗蛋白的降解与微生物合成蛋白时的氨利用水平。本试验研究结果表明，青蒿提取物可通过调控氨态氮促进瘤胃内微生物分解粗蛋白，进而促进瘤胃发酵，可能机理为青蒿提取物提高瘤胃内微生物活性。这与试验干物质消失率结果相一致，添加青蒿提取物显著提高奶牛瘤胃干物质消失率。综合来看，青蒿提取物可调控瘤胃发酵且无显著不良影响。

挥发性脂肪酸可提供反刍动物所需的主要能量，其组成比例及具体浓度可直接反应瘤胃代谢活动水平。瘤胃发酵生成的挥发性脂肪酸，包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、戊酸、异戊酸，其中乙酸、丙酸、丁酸占总挥发酸的95%左右。饲料中纤维物质与非纤维性碳水化合物经瘤胃微生物分解为丙酮酸。丙酮酸发生代谢转化，合成可被继续利用的营养物质，如乙酸、丙酸等挥发性脂肪酸，CO2和H2及CH4。糖降解过程中丙酮酸转化为乙酸和丁酸时产生H2，而氢可用于丙酸生成。CH4产量与瘤胃发酵产生的乙酸含量和乙酸/丙酸值呈正相关，与丙酸含量呈负相关[34]。本试验中，添加不同剂量的青蒿提取物对总挥发酸、乙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异酸均无显著影响；对丙酸影响效果显著，整体呈先升高再降低的趋势，在0.75%时达到最高值，2.00%丙酸减少可能是由于高剂量青蒿提取物抑制瘤胃丙酸生成；与对照组相比，添加不同剂量的青蒿提取物极显著降低乙酸/丙酸值，与王小晶等研究结果一致[25]，侧面印证丙酸结果。试验说明，青蒿提取物可以影响瘤胃发酵产生的挥发酸组成，从而改变瘤胃发酵模式；通过增加丙酸浓度竞争性消耗H2，降低乙酸/丙酸值，可调控瘤胃内甲烷生成。

产气量可评价饲料营养价值与可发酵程度，在一定程度上能衡量瘤胃微生物活跃程度总趋势。添加青蒿提取物对奶牛瘤胃体外发酵24 h产气量影响效果不显著。说明青蒿提取物不会影响瘤胃对饲料的正常发酵。而与对照组相比，0.50%和1.00%组极显著降低24 h甲烷产量，且甲烷产量先减少后升高，在2.00%组时高于对照组，与青蒿提取物存在剂量依赖关系。这与拜彬强等[24]、王小晶等[25]的研究结果一致，说明青蒿提取物可以显著调控甲烷的生成，且0.50%时抑制效果最佳。氢气是瘤胃中甲烷生成的主要底物。研究发现原虫可产生丰富的氢气，它们的去除(脱气)可使体内甲烷生成降低11%[35]。就植物提取物来说，其活性成分主要包括苷类、多糖类、挥发油、黄酮、单宁以及生物碱等，这些成分可显著抑制瘤胃原虫生长活性[36]。同时研究证实，青蒿提取物具有抑制多种原虫的作用[37]。故青蒿提取物抑制甲烷生成的机理可能是通过抑制原虫蛋白抑制瘤胃原虫，从而达到降低甲烷产量的效果。青蒿提取物对发酵液残渣中性洗涤纤维含量与对照组相比差异显著，总体呈先降低后升高的趋势，0.50%和0.75%组发酵残渣中性洗涤纤维含量显著低于对照组。研究发现饲料中中性洗涤纤维发酵越充分，甲烷产量相对越高[38]，从而青蒿提取物通过抑制中性洗涤纤维发酵可减少甲烷生成。故青蒿提取物可作为调控奶牛瘤胃甲烷抑制的绿色添加剂。

4 结 论

体外条件下，添加不同剂量的青蒿提取物对奶牛瘤胃pH、挥发酸及24 h总产气量均无影响，但升高氨态氮质量浓度及干物质消失率，降低乙酸/丙酸值。另青蒿提取物可有效抑制甲烷生成，综合考虑，添加0.50%青蒿提取物对奶牛瘤胃体外发酵及甲烷调控最适宜。