微小RNA-215-5p靶向eIF2a负向调控结肠癌细胞增殖

秦宝山，郭云霞，韩莉

(郑州人民医院 消化内科,河南 郑州 450000)

结肠癌的发生受多种分子通路的调控[1]。真核细胞翻译起始因子2a(eIF2a)是近年关注到的与肿瘤进展有关的因子，其不仅能调节细胞的翻译，还能促进肿瘤细胞的增殖及迁移[2-3]。近年学者研究发现肿瘤中存在多种微小RNA(miRNA)的异常表达[4]。miRNA是非编码RNA，通过多种方式、在多个层面调控DNA构象的改变、RNA的转录、蛋白质的翻译，主要作用特征是对靶基因的调控。我们应用生物信息学对影响结肠癌进展的miRNA进行筛选，选择在结肠癌中罕见报道的微小RNA-215-5p(miR-215-5p)进行研究[3]，并应用TargetScan网站预测相关靶基因，筛选出与miR-215-5p具有结合位点的eIF2a进行实验设计(图1)[5]，并基于此开展研究，关注miR-215-5p与eIF2a的靶向关系，探讨其对结肠癌细胞增殖的调控。

图1 TargetScan显示的miR-215-5p与eIF2a的结合位点

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择2014年4月至2015年3月期间确诊为结肠癌并行根治手术的患者55例。纳入标准：(1) 有明确的病理诊断，符合WHO中的标准；(2) 为首诊患者；(3) 临床随访资料完整。排除标准：(1) 伴有风湿免疫性疾病或遗传性疾病者；(2) 有林奇综合征者；(3) 术前行放、化疗者。选择肿瘤组织作为观察组，选择距肿物边缘>5 cm的正常结肠黏膜组织作为对照组。

1.2 细胞系

选择人结肠癌SW480细胞系(购于上海中乔新舟生物公司)复苏，在37 ℃、5%的CO2完全培养基中培养，3 d传1代，在细胞为对数生长期时收集细胞并计数进行实验，细胞密度约为5 000个·cm-2。

1.3 方法

1.3.1 miR-215-5p的检测 应用实时荧光定量PCR(qPCR)法检测miR-215-5p的表达。首先提取总RNA。引物由上海碧云天生物公司合成。miR-215-5p上游5′-TCACTGTGTGAACCGGACGTGTGTG-3′，下游5′-GCTAGCGTGGTTTTAAATCCGGT-3′。以U6作为内参，引物上游5′-GGCAGAAACGTGGAACCGGC-3′，下游5′-TTGGAACAGTGGGCAAATTCCG-3′。应用逆转录合成cDNA，扩增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，31个循环后进行延伸。于60 ℃采集信号。读取Ct值，以2-ΔΔCt法表示结果。ΔΔCt=[Ct目的基因(未知样品)-Ct对照(未知样品)]-[Ct目的基因(校正样品)-Ct对照(校正样品)]。

1.3.2 双荧光素酶报告基因实验 带有eIF2a的野生型、突变型3′-UTR的质粒由吉玛公司(中国，上海)合成。共转染荧光素酶报告基因质粒及miR-215-5p mimics，检测荧光素酶表达，观察miR-215-5p与eIF2a的3′-UTR结合情况。

1.3.3 蛋白印迹实验 构建空白对照组、空载体转染组、miR-215-5p转染组、miR-215-5p与eIF2a共转染组，应用蛋白印迹实验检测eIF2a、Ki67的表达。试剂购自上海碧云天生物公司。以GAPDH作为内参。依次进行蛋白提取、浓度测定、变性、加样、电泳、电转及免疫杂交，取出膜加入发光液 3 min后显影。以目的蛋白与GAPDH的比值作为相对量进行分析，应用Image J分析完成。严格实验质控。

1.3.4 免疫组化实验 Ki67和eIF2a浓缩液均购自苏州睿瀛生物技术有限公司，应用免疫组化SP法检测结肠癌中eIF2a(1∶150稀释)、Ki67(1∶200)的表达。基于石蜡包埋组织，切取4 μm切片，按实验步骤滴加一抗、二抗后行DAB显色。切片由病理科医师判读，应用盲法，eIF2a阳性部位是肿瘤细胞的细胞质和(或)细胞膜，Ki67阳性部位是细胞核，以棕褐色为阳性。观察切片中所有肿瘤组织的染色，在同一放大倍数(400倍)下随机选择5个区域进行计数，计数阳性细胞在同一视野内肿瘤细胞的比例，取平均值作为阳性率。Ki67的阳性率亦称为增殖指数。

1.4 统计学处理

应用SAS 6.12进行分析，定量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验或配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析(SNK法行两两比较)，率的比较应用卡方检验，相关分析应用Spearman相关分析，生存比较应用K-M生存分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般资料的特征

结肠癌患者共55例。男28例，女27例，年龄33～84岁，中位年龄61岁；高分化21例，中分化28例，低分化6例；淋巴结转移12例，无淋巴结转移43例；有脉管癌栓10例，无脉管癌栓45例。患者结肠癌及癌旁组织的病理学改变如图2。

图2 结肠癌病理组织学改变

2.2 结肠癌组织中miR-215-5p表达变化

与对照组相比，观察组组织中miR-215-5p的表达明显下降，差异具有统计学意义(2.54±0.53vs3.02±0.34,t=6.554,P<0.05)，见图3。

图3 结肠癌患者肠组织中miR-215-5p的表达(qPCR法) A. 扩增曲线(qPCR法);B.结肠癌患者肠组织中miR-215-5p表达比较的柱状图

2.3 结肠癌不同临床病理特征者miR-215-5p表达的比较

MiR-215-5p表达在不同肿瘤最大径和浸润深度组的差异有统计学意义(P<0.05)，而在不同性别、年龄、肿瘤分化程度、淋巴结转移和脉管癌栓组的差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 结肠癌不同临床病理特征者miR-215-5p表达的比较

2.4 miR-215-5p表达的生存分析

术后对患者进行了5年随访，截止时间点为2020年1月31日。共生存25例，死亡26例，失访4例。死亡患者术后生存时间为11～60个月，中位生存时间为45个月。K-M生存分析显示，miR-215-5p的表达与生存时间有关(临界值为2.54，χ2=6.33，P=0.006)。见图4、表2。

2.5 观察组miR-215-5p与eIF2a、Ki67的相关性

免疫组化检测eIF2a阳性率为15%～85%，平均56.3%，相关分析显示，miR-215-5p与eIF2a呈负相关性(r=-0.61，P=0.023)。Ki67阳性率为10%～95%，平均55.3%。相关分析显示，miR-215-5p与Ki67呈负相关性(r=-0.60，P=0.032)。见图5。

图5 观察组miR-215-5p与eIF2a、Ki67的相关性

2.6 eIF2a mRNA的3′UTR是miR-215-5p的直接靶点

构建含有野生型 mRNA 3′-UTR序列的pGL3-basic质粒(pGL3-eIF2a-WT)和miR-215-5p结合位点缺失的突变型eIF2a mRNA 3′-UTR序列的质粒(pGL3-eIF2a-MT)，分别与空载体转染组、miR-215-5p转染组的细胞进行培养，检测荧光素酶的表达。结果显示，miR-215-5p转染组能引起转染pGL3-eIF2a-WT的荧光素酶活性降低，而pGL3-eIF2a-MT的荧光素酶活性无明显影响，即eIF2a mRNA的3′UTR是miR-215-5p的靶点。见图6。

a P<0.05

2.7 miR-215-5p对结肠癌细胞系中eIF2a和Ki67表达的影响

应用qPCR对各组细胞系中miR-215-5p的表达进行验证。蛋白印迹实验检测eIF2a和Ki67的表达，与空白对照组及空载体转染组比较，miR-215-5p转染组的eIF2a、Ki67表达下降，共转染组能逆转上述改变。见表3、图7。

表3 不同组别细胞系中miR-215-5p和Ki67表达的比较

图7 miR-215-5p对结肠癌细胞系中eIF2a和Ki67表达的影响

3 讨 论

结肠癌临床生物学进展较为复杂，部分患者对治疗的反应性差。目前其发生发展的分子学机制不清楚。进一步探讨肿瘤发生、发展、浸润及转移过程的机制[6]，寻找评价其进展的生物学指标，可能对寻找结肠癌治疗的靶点有重要价值[7]。miRNAs的异常表达对结肠癌的进展有重要促进作用[8]，其不同亚型作用可能不同[9]。EIF2a分子质量为38 kDa[10]，由两个相互移动的结构域组成，即N端为具有S1型寡核苷酸/寡糖结合折叠子(OB)结构域和α螺旋结构域，C端为α折叠结构域[11-12]。α亚基为调节亚基和功能位点，具有调节肿瘤细胞增殖的作用。EIF2a可能是结肠癌形成和进展时调控的关键因子，其常受控于多种上游的miRNA，活化后对下游多种信号起调控作用[13-14]。本研究应用Ki67作为标记增殖指标的因子，效果理想，能客观反映其所标记细胞的特征。

本研究结果显示，miR-215-5p在正常结肠黏膜中有一定的表达量，在结肠癌中的表达下降，提示miR-215-5p低表达是结肠癌形成的分子事件，miR-215-5p可能具有抑癌基因样的作用。本研究miR-215-5p在不同肿瘤最大径及浸润深度组的表达差异有统计学意义，提示miR-215-5p低表达对肿瘤生长和侵袭具有一定的促进作用。本研究发现了miR-215-5p与eIF2a的靶向关系，提示二者具有通路作用，也证实了生物信息分析中二者结合位点的有效性。MiR-215-5p/eIF2a是结肠癌调控的关键分子[15]。本研究证实了此通路对结肠癌细胞的增殖具有调节作用，对结肠癌标本的组织学研究发现，miR-215-5p及Ki67与肿瘤最大径的大小呈负相关，也提示了其对细胞增殖的调控作用。MiR-215-5p作为抑癌因子，miR-215-5p低表达预示着肿瘤具有较强的侵袭作用及较高的临床分期，也预示着较高的淋巴道转移风险[16]。MiR-215-5p对细胞增殖的调控与对细胞周期的作用有关。有研究认为，miR-215-5p可能对调节G0/G1期有一定作用，使肿瘤细胞增殖速度加快[17]。MiR-215-5p/eIF2a通路中，miR-215-5p可能是上游因子，调控eIF2a发挥细胞增殖的作用[18]。本研究证实了在结肠癌的发生发展过程中eIF2a可能对Ki67起到了一定的调控作用，并认为eIF2a是预测结肠癌恶性程度的重要指标[19]。当eIF2α被激活时，通过对Ki67标记的肿瘤细胞和相关蛋白的影响[20-21]，有效促进肿瘤细胞的增殖，但是其具体的作用途径有待进一步研究。miR-215-5p对幼稚上皮细胞的转化可能有一定调节作用。本研究发现，miR-215-5p的表达与生存时间有关，提示检测miR-215-5p的表达对判断预后可能有帮助，即miR-215-5p低表达患者的预后差，但是miR-215-5p的临界值尚需要进行大检本、多因素分析后明确。

总之，miR-215-5p靶向eIF2a负向调控结肠癌细胞的增殖，miR-215-5p低表达是肿瘤形成和进展的重要事件，miR-215-5p的表达与生存时间有关。基于miR-215-5p/eIF2a通路进行多种生物学调控的研究有助于进一步阐明结肠癌的发生和进展的相关机制。