小分子活性多肽在骨组织工程中的研究进展

陈天洪 李景峰

武汉大学中南医院脊柱与骨肿瘤科430071

0 引 言

骨组织具有一定的自愈能力，在遭受创伤后能自我修复。然而,这种自愈能力有一定限度，在面对较大或难治性骨缺损时修复效果差，因此需要寻找一些新的材料来修复这类骨缺损。目前，修复效果最好的方法是自体骨移植，因为自体骨供体不仅可以提供合适的骨基质支持新骨生长，而且无免疫排斥反应。然而优质的自体骨供体来源有限、易感染等缺点使其应用具有很大的局限性[1]。同种异体骨移植也是骨缺损的修复方法之一。这种方法避免了供体部位的并发症，同时来源丰富，易于获取，但有免疫排斥、传播疾病的风险，同时其成骨诱导活性较低且骨折风险较高[2]，也具有很大的局限性。与自体骨和同种异体骨相比，人工合成骨不仅具有良好的生物相容性和生物降解性，同时还弥补了自体骨来源有限，异体骨免疫排斥等缺点。因此，人工合成骨逐渐成为骨组织工程的研究热点。

为了提高骨组织工程生物材料的骨诱导活性，常常复合骨诱导活性因子。在成骨诱导方面，最常用的生长因子是骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）。BMP 是转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族中的一员，能诱导骨祖细胞有丝分裂并分化为成骨细胞，其中BMP-2、BMP-7 等已经被批准在临床或商业中使用。然而，BMP 也具有一些缺点，包括成本较高以及长期使用可能导致骨肿瘤等[2-3]。为了克服这些缺点，在此基础上进行改构的小分子活性肽的应用越来越广泛。这些小分子活性肽一般是短肽序列，成本较低，也不易引起排异反应。相较于较长链的骨诱导活性因子，在相同面积的骨生物支架材料上能负载更多量和/或类型的小分子活性肽，使不同类型的小分子活性肽可以协同发挥效应，从而进一步提高骨生物材料的成骨诱导活性，同时还可实现小分子活性肽的可控释放。

对几种常见的用于骨组织工程的小分子活性肽的研究进展进行综述。其中，除了能直接诱导成骨分化的小分子活性肽外，还包含了促种子细胞黏附以及血管生成的小分子活性肽。黏附及增殖是细胞成骨分化的必然途径，而血管生成对新骨形成也至关重要，因为血管化为新骨生长提供了必须的成骨诱导因子等营养物质。

1 用于骨组织工程的小分子活性多肽

1.1 促黏附肽

1.1.1 Arg-Gly-Asp（RGD）肽

RGD 肽是纤连蛋白中最短的促细胞黏附的氨基酸序列，广泛存在于玻连蛋白、层黏蛋白、骨桥蛋白和骨涎蛋白等多种细胞外基质蛋白中，可用于刺激细胞表面黏附[4]。RGD 肽已经被证明能在多种生物活性材料上促进MC3T3-E1 细胞以及人间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）的黏附或成骨分化[5-9]，并能在兔体内促进新骨形成[10]。但一项使用两种物质介导RGD 修饰磷脂双分子层的研究取得了不同的结果，即使用1，2-二油酰基磷脂酰胆碱介导的RGD 能促进磷脂双分子层上hMSCs 的成骨分化，而1，2-二棕榈酰基磷脂酰胆碱介导的RGD 却对磷脂双分子层上的hMSCs 分化没有影响[6]。还有研究结果表明，RGD 对液晶材料上的细胞没有促黏附作用[7]。这些不同的结论目前并没有被进一步研究。但研究者已经发现了一些能影响细胞黏附和分化的因素，如细胞的黏附水平与RGD 肽在材料表面的密度和迁移率呈正相关，而且肽的浓度还影响细胞的形状，浓度越大，细胞越长、圆度越低[6]。

1.1.2 胶原模拟肽

胶原模拟肽能结合细胞膜整联蛋白，介导细胞黏附。胶原模拟肽P-15 能促进MC3T3-E1 细胞在生物活性材料表面的黏附和增殖[11]。P-15 多肽能促进材料表面功能化从而增加犬下颌骨中的骨-种植体的接触面积[12]。为了评估胶原模拟肽的促黏附效应，研究者使用RGD 肽与胶原蛋白I 衍生肽DGEA 进行比较[13]，结果显示DGEA 肽促细胞黏附效应低于RGD 肽，但诱导成骨效应更强。另一项对胶原模拟肽AC-GCG（OPG）7（CMP）与RGD 肽的研究结果显示，CMP 在体内的促成骨效应明显优于RGD 肽[14]。

1.1.3 肝素结合肽

成骨细胞与细胞外基质的黏附除了通过整合素与RGD 介导外，还能由基于跨膜蛋白多糖与肝素结合序列的相互作用介导[15]。肝素结合肽是第二种途径中重要的小分子活性多肽。为了模拟细胞外基质与整联蛋白以及蛋白多糖受体之间的协同作用，研究者开发了同时复合RGD 肽和肝素结合肽的生物活性材料。这种材料可明显促进成骨细胞的黏附、增殖和分化。但在细胞黏附与增殖方面，RGD和肝素结合肽并没有显示出明显的协同效应。细胞培养结果显示单独的肝素结合肽和RGD 肽产生的促细胞黏附和增殖效应优于这种新材料，在增殖和矿化方面，三者的促进效果相近。这可能是由于两种肽实际暴露于细胞的量与比例无法准确调控造成，其具体机制仍需进一步研究[16-17]。

1.2 骨诱导肽

1.2.1 骨形态发生蛋白-7 衍生肽

骨形成肽-1（bone forming peptide-1，BFP-1）是骨形态发生蛋白-7（BMP-7）不成熟区域的衍生肽。Li等[18]和Yang 等[19]的研究结果均证明BFP-1 能增强成骨相关基因、蛋白、转录因子以及酶的表达和活性，从而促进脂肪来源间充质干细胞（adiposederived MSCs，ADMSCs）和骨髓来源间充质干细胞（bone MSCs,BMSCs）的成骨分化。Li 等[18]还证明了BFP-1 能促进裸鼠背部的血管及新骨形成，发现BFP-1 增强了生物活性材料的亲水性、细胞黏附性以及生物相容性，在促进细胞成骨分化的同时还促进了细胞的黏附。但BFP-1 肽的促黏附效应并不强，Luo[20]等设计了一种RGD 与BFP-1 顺序释放的双肽负载藻酸盐杂交系统，这种系统在早期释放RGD 肽能增强细胞黏附和增殖，晚期释放BFP-1 则诱导成骨分化，实现了RGD 肽与BFP-1 的协同促成骨作用。值得一提的是，Wang[21]等发现BFP-1 能通过提高Smad 1/5 蛋白的磷酸化水平，增强兔内皮祖细胞的迁移能力以及某些血管形成基因的表达，并在兔体内诱导更多和更好的血管以及新骨形成。

1.2.2 骨形态发生蛋白-2 衍生肽

多种BMP-2 的衍生肽，如OP 肽[22]、BMP-2 残基73-92[23]和BMP-2 残基32～48（p17-BMP-2）[24]已被证明能增强MSCs 的成骨分化标志物——碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Runx2 基因以及相关蛋白的表达，并在兔或老鼠体内促进新骨形成，同时能促进被修饰材料表面的钙沉积，表明BMP-2 衍生肽对成骨分化具有促进作用。值得一提的是，有研究发现地塞米松可加强BMP-2 残基73-92 的骨诱导活性，同时当BMP-2 残基73-92 修饰介孔二氧化硅粒子时，还使这种粒子获得了更好的细胞相容性及细胞摄取效率[23]。由于BMP 衍生肽仅仅是BMP完整序列的一部分，因此其骨诱导能力远不如BMP强大。研究者发现，在一定的浓度范围内，即使BMP-2 残基73～92 的浓度达到BMP-2 的12 000倍，其骨诱导能力仍然不及完整肽链的BMP-2[25]。Li等[26]利用BMP-2 功能结构域中的20 个氨基酸片段合成了一种新肽P24，与前面几种衍生肽不同，当将P24 肽与重组人骨形态发生蛋白-2（recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2）进行比较时，发现P24 肽的骨诱导能力与rhBMP-2 相近，并且P24 与rhBMP-2 能一起使用并发挥协同效应。

1.2.3 胰高血糖素样肽

糖尿病患者较常人有更高的骨质疏松患病率[27-28]以及骨折风险，某些糖尿病药物甚至对这种风险有促进作用[29]。胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1,GLP-1）是一种治疗糖尿病的药物，被证明具有促成骨作用。其在治疗糖尿病的同时，能预防骨质疏松等疾病，对于糖尿病患者，特别是老年糖尿病患者有巨大的临床应用价值。使用GLP-1 受体激动剂exendin-4（Ex-4）治疗骨质疏松大鼠时，能发现其增强了大鼠的骨形成和骨强度；在体外细胞培养中，研究者发现Ex-4 能促进骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）向成骨细胞分化，同时抑制其分化为脂肪细胞[30]。此外，Ex-4 还能改善衰老成骨细胞的增殖[31]并抑制骨吸收[32]。研究者发现，长期使用GLP-1 受体激动剂能防止人体质量减轻后的骨质流失[33]。但并不是所有GLP-1 受体激动剂都能降低治疗对象的骨折风险，有分析认为这可能是由于它们分子结构的差异所导致[34]。但想要找到解释这些差异的具体原因，就必须明确GLP-1 受体激动剂促进骨形成的机制，但这种机制目前并不完全明确。Meng 等[30]发现Ex-4 增加了β-连环蛋白在细胞质中的积累和细胞核中的转运，改善了成骨调节因子的表达，并通过经典的Wnt/β-连环蛋白传导途径调节BMSCs 成骨分化。通过对Wnt/β-连环蛋白系统的下游效应子的进一步观察发现，GLP-1 受体激动剂通过双重途径促进成骨，即由CAMP/PKA/β-连环蛋白/转录因子7 样2 途径启动成骨分化，由PKA/P13K/AKT/GSK3β 途径抑制β-连环蛋白降解并促进其在BMSCs 中的积累。也有研究者认为，二型糖尿病可能对Wnt/β-连环蛋白传导途径具有抑制作用，而GLP-1 受体激动剂能减轻这种抑制作用[35]。

1.2.4 成骨生长肽

成骨生长肽（osteogenic growth peptide, OGP）是一种天然存在的14 肽，其氨基酸序列与组蛋白H4 的C 末端89～102 片段相同，具有促成骨作用[36]。OGP（10～14）是OGP 序列中的第10～14 氨基酸片段，是OGP 最小的衍生片段及生理活性形式[37]。将OGP（10～14）复合到改性聚乳酸[38]和钛（titanium，Ti）[39]等材料上时，能促进成骨细胞的黏附、增殖、分化、ALP活性、钙沉积及基因表达，从而发挥成骨诱导作用。在与Ti 复合时，OGP（10～14）还能抑制破骨细胞的表达，减少骨流失。Li 等[40]认为，OGP 可能通过增加AK141205 基因及CXCL13 mRNA 的表达介导促成骨作用，并可通过沉默成骨细胞中的AK141205 基因，减弱OGP 的促成骨作用。

1.2.5 甲状旁腺激素相关肽

甲状旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）是一种含有84 个氨基酸的多肽，在机体钙调节和骨重塑中发挥重要的生理作用。研究结果表明，PTH 序列N 端的前34 个氨基酸片段PTH（1～34）保留了其大部分功能[41]。PTH（1～34）对机体具有双重作用，持续高剂量不利于骨形成，而间歇高剂量或持续低剂量则能促进骨的形成与再生。PTH（1～34）促进骨形成的能力使其在骨组织工程中具有巨大的潜力。然而，给药不便以及存在全身暴露的潜在风险等缺点限制了PTH（1～34）的应用[42]。为了克服PTH（1～34）的上述缺点，Yang 等[42]自主设计并合成了一种新肽PTHrP-1，其能被生物材料高效负载并持续地释放，在促进兔桡骨缺损处新骨形成时，呈剂量依赖性；此外，其可在体外促进MC3T3-E1 细胞的ALP 活性、细胞增殖以及cAMP 和RUNX2 基因的表达。此外，Liang 等[43]还发现PTHrP-1 能促进血管生成标志物的表达，这说明PTHrP-1 还具有促血管生成能力。值得注意的是，PTH（1～34）的促成骨作用是在间歇性的高剂量暴露下实现的，然而在文献[42]报道的研究中，PTHrP-1 为持续释放，但仍然促进了骨形成。这可能是由于PTHrP-1 改构后，与PTH 受体结合位点改变有关，但需要进一步对PTHrP-1 的促成骨机制进行研究以解释这种现象。此外，PTH 相关肽的促成骨机制可能与Smad 依赖的典型BMP 受体信号通路、Wnt 信号通路以及Smad 无关的非典型BMP 受体信号通路的激活有关[42]，但具体机制有待进一步研究。

1.3 促血管生成肽

1.3.1 QK 肽

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）衍生的QK 肽已经被证明具有与重组VEGF 相当的促血管生成潜力[44]。研究者发现，QK肽可促进人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）的增殖[45]。为了更好地发挥QK 肽的促血管生成潜力，研究者研发了2 种能实现QK 肽可控释放的方法。第一种方法是使用含不同数量谷氨酸的聚谷氨酸结构域合成QK 肽。研究结果表明，QK 肽的释放顺序与谷氨酸数量呈负相关[46]。同时也有研究结果表明，谷氨酸结构域合成的QK 肽促血管生成活性与单纯QK 肽没有差异，并且谷氨酸还增强了QK 肽与骨组织工程材料（无机牛骨和羟基磷灰石）的黏附力[47]。第二种方法是使用聚乙二醇水凝胶纳米颗粒负载QK 肽，通过改变纳米颗粒的交联密度调节QK 肽的释放速率，纳米颗粒的交联密度越低，QK 肽释放越快[48]。

1.3.2 艾塞纳肽

艾塞纳肽（Ex-4）是一种GLP 受体激动剂，已经被批准作为糖尿病治疗药物。Seo 等[49]使用Ex-4促进了糖尿病小鼠背部伤口的愈合，同时增强了HUVECs 的增殖、分化以及人角质形成细胞中VEGF的表达。Kang 等[50]则发现Ex-4 改善了后肢缺血损伤小鼠的血流动力学，减少了肌肉的局部组织损伤，增加了腓肠肌中血小板-内皮细胞黏附分子（CD31）的染色面积，并可促进血管生成因子表达。Roan等[51]还发现Ex-4 能抑制超氧阴离子产生及降低血清中白细胞介素6 的浓度，从而减轻糖尿病小鼠伤口的炎性反应。上述结果提示，Ex-4 对血管生成存在有益作用。Qi 等[52]发现Ex-4 的促血管生成效应可能通过P18K/AKT 通路介导，但相关机制有待进一步研究。

1.3.3 PR1P 肽

Prominin-1 衍生肽（prominin-1 derived peptide，PR1P）是最新被设计出来的含有12 氨基酸序列的多肽[53]，其能直接结合VEGF，促进VEGF 与血管内皮细胞、VEGF 受体2 以及神经菌毛蛋白-1 的结合。研究结果显示，联合使用PR1P 肽与VEGF 能促进小鼠左耳以及脉络膜的伤口愈合和血管生成，同时还能增加小鼠右腿的血流灌注。但单独使用PR1P肽并不具有促血管生成的能力，将PR1P 肽单独注入角膜后并没有增加新生血管的生成；而将PR1P肽与VEGF 一起注入角膜却促进了角膜新血管的生成。因为角膜不含有内源性VEGF，这说明PR1P肽只能通过与VEGF 结合并促进其活性来实现促血管生成作用。

2 结 语

目前，研究者已开发了多种可用于骨组织工程的成骨小分子活性多肽。尽管针对小分子活性多肽的研究依然有限，尤其在机制、用法、可控调节，双肽甚至多肽协同效应等方面仍有待进一步研究，以揭示相关机制。例如，RGD 肽在促进细胞黏附上有相互矛盾的结果[11]，细胞外基质与RGD 肽、肝素结合肽在细胞黏附上并未发挥出预计中的协同效应[16-18]，使用不同方法缀合到材料上的小分子活性多肽效用存在巨大差异[12]，等。但无法否认，小分子活性多肽在骨组织工程中的应用已经取得了巨大的进展，有许多小分子活性多肽被用于修饰生物材料并且在体内和体外实验中取得了较好的促成骨效果，短链小分子多肽的促进能力丝毫不逊色于长链多肽[44]。这些小分子活性多肽相较于传统的生长因子，具有成本低、易于调控，效用安全等优点，在未来的骨组织工程研究与应用中具有无法估量的应用潜力。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突