非酒精性脂肪性肝病肠道黏膜机械屏障功能的研究进展

张玮 李华南 骆雄飞 刘斯文 赵娜 包安 陈英英 王金贵

天津中医药大学第一附属医院推拿科300193

0 引 言

非酒精性脂肪性肝病[1]（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是与胰岛素抵抗和遗传易感密切相关的代谢应激性肝损伤。近年来，随着生活水平的提高，人们的饮食结构逐渐改变，NAFLD 的发病率不断升高且呈低龄化趋势[2]，已成为21 世纪全球重要的公共健康问题之一。调查报告显示，全球的NAFLD 患病率已达25.24%[3]。在我国汉族人群中，NAFLD 的发病率达33.3%[4]，已成为仅次于病毒性肝炎的常见肝病。有研究人员对瑞士的36 例NAFLD 患者进行了27 年的跟踪随访，发现最后有25%的患者被诊断为肝硬化，14%的患者被诊断为肝细胞癌[5]。据统计，中国也已成为年龄标准化发病率最高的地区之一[6]，而NAFLD 正是诱发肝癌风险的首要因素[7-8]。因此，防治NAFLD 已成为降低肝癌发病率和死亡率的重要医学策略。目前，随着“肠-肝轴”概念的广泛认知，NAFLD 的研究焦点也逐步前移至肠道。剖释NAFLD 的发病机制，其关键环节为肠道机械屏障的破坏[9]。因此，如何维护肠道机械屏障功能，重建“肠-肝轴”平衡，已成为未来潜在的研究热点。

1 肠道通透性是NAFLD 发病的关键环节

肠道是人类能源物质递呈的主要器官，同时也参与人体各类代谢、免疫等重要功能。肠道与肝脏拥有共同的胚胎起源，故两者在生物学功能及解剖结构之间存在诸多联系，并拥有共同的血液、营养等功能单元。因此，在Marshall[10]正式提出“肠-肝轴”概念后，肠道成为NAFLD 防治研究的热点。

肠道屏障包括机械屏障、免疫屏障、生物屏障及化学屏障。其中对于机械屏障，即通常所称的肠上皮屏障的功能研究最为集中。肠道机械屏障在维持人体与外环境稳态上发挥着至关重要的作用。其作为抵御外源性物质的第一道防线，不仅要与肠道菌群共存，更要防止菌群失调易位后引起的一系列反应。而肠道黏膜通透性正是反映肠道机械屏障功能的重要指标。虽然肠道菌群已成为全球研究热点，但NAFLD 发病机制中的关键环节为肠道黏膜通透性的增加。无论是菌群失调还是易位，均要通过内毒素等途径增加肠道黏膜的通透性。在正常情况下，肠内菌群及毒素均不能通过机械屏障进入肝脏。然而，由于人们对饮食控制的不节制，使肠道内脂多糖不断蓄积，引发一系列炎症反应，逐步破坏了肠道机械屏障功能，导致肠道通透性增加。此时，脂多糖等毒素会透过被破坏的机械屏障进入门静脉，使肝细胞脂肪变性，引发NAFLD 发生。

肠道通透性的作用最初在NAFLD 机制研究中被证实[11]。多项研究结果显示，NAFLD 的严重程度与肠道通透性的高低显著相关[12-15]。早期的一些研究结果发现，在肠道形态学发生变化之前，肠道通透性即已增加[16]。

2 维持NAFLD 肠道通透性的主要因素

肠道机械屏障的解剖基础源自于肠上皮细胞（intestinal epithelial cell,IEC）及相邻细胞之间的连接构成。两者均为维持NAFLD 肠道通透性的主要因素。IEC 的连接装置主要包括紧密连接和黏附连接，两者统称为顶端连接复合体（apical junctional complex，AJC）。IEC 需要AJC 组装，而AJC 又需要锚定IEC，两者作用不能孤立存在，故IEC 功能的正常和AJC 结构的稳定在调控NAFLD 肠道通透性中发挥着重要作用。下文将对IEC 功能和AJC 结构涉及的主要因素进行系统整理。

2.1 细胞凋亡

细胞凋亡是机体清除衰老、畸形细胞的一种主动程序化过程。在生物组织中，损伤和衰老细胞均以凋亡形式被清除，以控制机体内细胞质量和数量的平衡。IEC 作为肠道机械屏障组成的主体，其凋亡功能是维持肠道通透性的基础。IEC 具有较强的再生和修复能力，在机体受到外界因素侵袭时，可在一定范围内维持凋亡稳态，保证IEC 及时修复和更新。若超出IEC 自稳代偿期，则会诱发IEC 凋亡紊乱，IEC 功能受损，肠道通透性增加[17]。有研究人员通过遗传方法加速IEC 凋亡，结果引起IEC 分化不全，肠道通透性增加[18]。纠正凋亡进程，不仅可降低肠道黏膜通透性[19]，甚至还可上调AJC 中紧密连接的表达[20]，从而共同修复受损的肠道通透性。上述研究结果证明，IEC 凋亡功能在维护肠道黏膜通透性中起到关键作用。

2.2 细胞自噬

细胞凋亡与细胞自噬是维持IEC 正常功能的两种生命活动。虽然两者在代谢途径方面有着显著区别，但均为调控肠道通透性的关键机制。细胞自噬是细胞用来回收利用细胞质成分、废弃或受损细胞器的一种自体降解途径。当细胞受到外源性刺激时会启动自噬，形成双层膜囊泡结构的自噬体，自噬体在内吞废弃细胞器后与溶酶体融合，将内容物及自噬体本身分解成细胞的基本成分，从而实现循环利用。例如细胞营养匮乏时，自噬会通过循环回收利用的途径提供能量，以维持细胞凋亡水平。

文献报道，肠道机械屏障破坏后，自噬相关蛋白Beclin l 及微管相关蛋白1 轻链3B（LC3B）表达上调[21]，表明细胞自噬的活性在机械屏障损伤后增强，自噬可能参与保护肠道机械屏障，其机制可能是通过清除受损细胞器以发挥修复受损IEC 的作用。通过干预自噬的方法，可引发细胞凋亡延迟，从而导致宿主细胞被病毒持续感染，这也证明自噬为凋亡所需，两者关系密切。自噬可通过调控IEC凋亡稳态参与修复肠道机械屏障功能。抑制自噬发生会促进IEC 过度凋亡[22]，导致肠道黏膜通透性增加[23]。而上调自噬相关蛋白Beclin 1 的表达，可恢复正常细胞凋亡节奏，降低肠道黏膜通透性[24]。

2.3 AJC

紧密连接和黏附连接是AJC 的主要组成部分。紧密连接位于AJC 的最顶端，是AJC 最重要的连接方式，在维持肠道通透性中发挥重要作用[25-26]。脂多糖等毒素从两个IEC 之间的缝隙通过时会受到紧密连接的限制。紧密连接由闭合蛋白Claudin、咬合蛋白Occludin 和连接黏附分子3 种膜蛋白以及闭锁小带蛋白[闭锁小带蛋白1（zonula occludens 1，ZO-1）、ZO-2 和ZO-3]等外周胞浆蛋白组成，可与相邻细胞包裹形成一个连续的渔网状结构。文献报道，紧密连接蛋白的含量与肠道通透性成反比[27-28]，证明紧密连接蛋白与肠道通透性关系密切。给予体外培养IEC 加载一定的机械力，可干预紧密连接ZO-1 蛋白的表达[29]，这为组装AJC 提供了基础，有利于改善肠道机械屏障功能。然而紧密连接的结构稳态需要通过锚定细胞骨架蛋白来实现。ZO-1 蛋白与紧密连接的功能变化密切相关[30]，常被作为紧密连接通透性的指标[31]。ZO-1 蛋白可与细胞骨架蛋白进行广泛连接，并通过锚定细胞骨架蛋白来组装和稳固AJC，故其在AJC 的组装和功能变化中起着重要作用。

黏附连接位于紧密连接下方，决定着IEC 的黏附能力。其对于保持IEC 的完整性和细胞间的协调起着至关重要的作用[32-33]。黏附连接包括E-钙黏蛋白、γ-连环蛋白、α-连环蛋白和p120 连环蛋白。其中E-钙黏蛋白在维持黏附连接结构稳态中发挥着重要作用。纳米力学测量结果显示，E-钙黏蛋白可识别细胞骨架蛋白纤维形肌动蛋白（fibrous actin，F-actin）之间的缝隙，从而锚定细胞骨架蛋白[34]，利于AJC 的稳固。此外，E-钙黏蛋白的聚合和解离平衡对于维持细胞的正常形态和结构亦十分重要。E-钙黏蛋白表达下调会加重缺氧诱导的IEC 凋亡，而E-钙黏蛋白表达上调对IEC 具有保护作用[35]。人工干预打破E-钙黏蛋白的聚合和解离平衡后，E-钙黏蛋白的结构发生改变，黏附连接解离[36]，细胞间的黏附力下降，不仅可引起细胞脱落和凋亡，还可干扰紧密连接上皮屏障功能[37]。

2.4 细胞骨架

细胞骨架是真核细胞中重要的组成部分和功能组件。其为位于细胞膜内侧的蛋白质纤维网架系统，主要由微丝、微管、中间丝组成。但其并非真正的“骨”，而是一个高度动态的结构，在细胞膜下方组装成机械支撑装置，并根据外界机械力改变而调控细胞骨架的空间分布和动力学行为，将外界刺激信号转化为细胞骨架的动力学行为。细胞骨架不仅可直接连接于IEC 上，对细胞间的AJC 也起到组装和支撑作用[38]。

IEC 之间的排列组合形成了沟通肠道内外的最大和最重要的屏障。IEC 之间的缝隙虽需紧密连接和黏附连接进行密封而保持肠道屏障功能[39]，但在紧密连接和黏附连接密封的同时，还需锚定细胞骨架蛋白，借助细胞骨架的力学结构组装AJC，以使其结构和功能达到稳定。微丝骨架可通过靶点锚定紧密连接和黏附连接蛋白，从而维持AJC 的稳态和组装。一些早期的研究结果证实，微丝骨架蛋白破坏素可诱导AJC 快速解体，表明微丝骨架在AJC 组装中具有重要作用。其中紧密连接的ZO-1 蛋白和黏附连接的E-钙黏蛋白与微丝骨架蛋白肌动蛋白相连，承担着细胞信号沟通的重要作用，也已成为细胞骨架相关研究的热点。药理学研究结果显示，肌动蛋白解聚试剂（如细胞松弛素）可使鼠回肠黏膜上皮的通透性增加[31]，而撤去药物干预后，微丝骨架又可逆转，证明可通过外界干预对细胞骨架进行重塑和改造。此外，一定的力学刺激也可改善F-actin的解聚状态，使细胞内游离的球形肌动蛋白（Gactin）彼此结合形成F-actin，进而通过自身螺旋形成微丝，此过程即为细胞骨架的重塑[40]。另有研究结果证实，给予体外培养细胞一定的机械外力可诱导细胞微丝骨架蛋白重塑，且机械力是骨架蛋白重塑所必需的[41]。机械力可调控细胞骨架重塑，使其与紧密连接相互锚定成复合结构。因此，肠道通透性的高低与细胞骨架组装AJC 的稳态关系密切。而ZO-1蛋白和E-钙黏蛋白均可直接锚定于细胞骨架上，故细胞骨架已成为NAFLD 的潜在研究热点。

由于AJC 需与结构功能正常的IEC 配合才能共同发挥调控肠道黏膜通透性的作用，因此IEC 结构稳态也是调控通透性的关键因素之一。细胞是生命体活动的结构和功能的基本单位，时刻都在感受来自内外环境的各种信息的刺激，并根据信息作出相应的功能调整。而在整个信号传导链条中，贯穿整个细胞的细胞骨架是调控力学信号传导的枢纽[42]，使力学刺激从细胞表面向内传播，为力学信息-化学信息传导提供了物理基础。

新近的研究结果发现，细胞骨架在凋亡过程中的改变非常活跃，其在细胞内的状态直接影响凋亡信号的终点。细胞骨架是真核细胞中复杂的纤维网状结构体系，在细胞内物质运输、细胞运动、信息传递等活动中发挥着关键作用[43]。在正常细胞凋亡过程中，细胞骨架会重新排列，形成一个椭圆形的凋亡微管网络以保证细胞的形态。因此，正常、可控的细胞凋亡最终形态为椭圆形。当细胞骨架破坏后，会引起骨架无序重组，排列畸形，细胞空间结构也随之重构，严重影响了细胞的功能活动，导致细胞凋亡稳态的失衡。已有研究人员采用破坏细胞骨架的方式诱导小鼠卵母细胞凋亡，以降低细胞早期胚胎的发育能力[44]。特别是在肿瘤领域，细胞骨架已成为新药开发的新靶点。细胞自噬是细胞自我保护的机制，其正常运转需要细胞骨架的支持。其中微管与微丝参与自噬活动的全部进程[45]，可为自噬活动提供定向运动轨道，并指引自噬体的运输。NAFLD肠道内蓄积的脂多糖会诱发炎症破坏细胞骨架，致使骨架无序重组，排列畸形，细胞空间结构也随之重构，同时致使细胞内自噬体蓄积，且分布混乱，严重影响了细胞的内环境稳态，导致细胞过度凋亡[46]。有研究结果显示，诱导大鼠IEC 炎症反应，早期时细胞反应明显，自噬活性较高，但随着病程进展自噬反而被抑制[47]。其原因即为长期的炎症刺激导致细胞骨架拆分塌陷，无法支持自噬的正常启动和转运。微丝蛋白可为自噬体的转运提供一个通畅的纤维网络[44]。该网络可在结构上支撑自噬泡的扩张[48]，并于自噬体成熟后在尾部聚合并快速循环组装与分解，形成一个“彗星拖尾”，以推动自噬体从网膜体分离，并负责其早期的移动与转运[49]。采用解聚剂和基因敲除方法拆解微丝蛋白，不仅可抑制自噬体的产生[45]，还可导致细胞凋亡增加。微管也是细胞骨架的主要组成之一，具有支持物质运输、细胞器定位的作用。因此，细胞骨架结构对于IEC 的正常凋亡和自噬功能具有重要意义。

2.5 主要信号通路

关于信号在IEC 内的传递途径，目前国内外学者主要认为有Rho 家族、蛋白激酶C、整合素、丝裂霉素激活的蛋白激酶、Ca2+通道等途径。其中Ca2+通道与细胞骨架结构联系紧密。有研究人员认为，细胞的坏死和凋亡主要由4 种细胞毒性机制调节。细胞骨架为破坏机制之一，而细胞内固有游离Ca2+浓度的持续增加便是主要结局。因此，许多研究人员利用Ca2+通道选择性地使微丝和微管稳定或去稳定，以调控肠道黏膜的通透性。现阶段对于调控肠道黏膜通透性的信号通路研究更多聚焦于Rho 家族与肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kinase，MLCK）两个信号通路。Rho 家族下游的效应分子Rho 激酶（Rho-associated kinase，ROCK）在调控AJC拆解中发挥作用，但其多定位于细胞中央，而MLCK多定位于细胞外围，这种定位差异意味着细胞骨架蛋白在细胞中央远比细胞外围稳固，且细胞外围对外界刺激更为敏感。因此，MLCK 信号通路被认为是参与调控肠道黏膜上皮屏障最重要的信号通路之一[50]。

肌球蛋白轻链（myosin light chain，MLC）磷酸化是肠道通透性改变的分子基础，其可通过调控微丝骨架结构影响肠道通透性。MLCK 信号通路则可通过干预MLC 磷酸化水平，进而调控骨架蛋白来影响肠道通透性。诸多研究结果证实，脂多糖等毒素的蓄积可诱导MLCK 基因转录活性增加，MLC 磷酸化水平升高，引起细胞微丝骨架结构改变和AJC 解体，从而导致细胞间隙增大，通透性增加[51-52]。上述研究结果也证实，MLCK 蛋白表达上调是肠道通透性增加的重要原因。因此，特异性抑制MLCK 信号通路是调控肠道通透性的关键。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteine aspartic acid specific protease，Caspase）级联反应的激活是细胞发生凋亡的标志性事件。特别是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）作为凋亡下游的终末剪切酶，在细胞凋亡执行过程中起到至关重要的作用。当Caspase-3 非正常活化后，可介导ROCK1 活化及MLC 磷酸化，从而激活Caspase-3/ROCK1/MLC 信号通路的层级级联，引起细胞凋亡[53]。同时，Caspase-3的活化还可切割ULK1 激酶。ULK1 激酶是自噬启动的关键分子机制，其可通过磷酸化Beclin-1，激活脂酶VPS34，从而诱导自噬启动。因此，Caspase-3 活化不仅是凋亡的级联反应，更是深藏于细胞骨架、自噬和凋亡中的枢纽元件，是调控肠道黏膜通透性的关键。

MLC 磷酸化是Caspase-3/ROCK1/MLC 信号通路诱导细胞凋亡的终末效应，也是细胞骨架拆解的关键环节。文献报道，在凋亡过程中通过拮抗细胞骨架拆解的方式，可抑制MLC 磷酸化，而这种抑制可反向调节Caspase-3 的活性，从而阻断Caspase-3/ROCK1/MLC 信号通路的激活，实现细胞凋亡的逆转[43]。这与笔者所在课题组的前期研究结果一致：揉腹法可通过特异性抑制MLC 磷酸化的途径重塑细胞骨架。上述研究结果高度证实了重塑细胞骨架借助阻滞Caspase-3/ROCK1/MLC 信号通路逆转细胞凋亡的可能性。然而，单纯阻滞细胞凋亡仍不足以使细胞恢复正常代谢状态。如何清除凋亡启动后的废弃受损细胞器和错误折叠蛋白，以促使细胞步入正常的凋亡进程，尚需进一步深入研究。

3 结语与展望

NAFLD 是仅次于病毒性肝炎的常见肝病，目前尚无确切有效的治疗药物，若不及时干预，会引发一系列全身系统疾病，严重影响患者的生活质量和生命安全。越来越多的研究结果证实，NAFLD 的严重程度与心血管疾病、肾脏疾病的严重程度密切相关，其已成为肾功能衰竭、高血压病、大肠癌的一个独立危险因素[54-56]。然而据调查，在美国仅有18%的NAFLD 患者意识到NAFLD 的潜在危险[57]。在当今医疗卫生工作发展的趋势已向预防前移的同时，及时治疗并预防NAFLD 的进一步发展已受到国内外广大学者的高度重视。其中以改善肠道通透性为干预靶点的治疗方法可逆转肠道黏膜屏障损伤，预防NAFLD 的进一步发展[58-59]。因此，如何正确认知细胞骨架、AJC、凋亡、自噬之间的关系，平衡各环节的有效衔接以调控肠道黏膜通透性将成为未来研究NAFLD 的主流方向。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突