半枝莲中4种黄酮类化合物的含量测定*

SONG Haneun(宋汉恩)，任 燕

(滨州医学院，山东 烟台 264003)

半枝莲主要产于华东、华南、西南等地[1]，其全草入药。半枝莲具有多种功效，不仅可内用于治疗多种炎症，也可外用于跌打损伤[2]，但最为引人注目的是其抗癌功效[3-7]。半枝莲化学成分多样[8]，多名学者已经证明半枝莲中黄酮类物质为主要的药效物质[9-10]。目前，半枝莲中已检测出几十种黄酮类物质[4-5]。其中野黄芩苷、野黄芩素、木樨草素和芹菜素是其主要的黄酮类成分，均具有一定的抗癌功效。因此，本试验选用半枝莲中野黄芩苷、野黄芩素、木樨草素和芹菜素作为研究对象，建立一种同时测定半枝莲中这四种化合物的高效液相色谱方法，该方法亦可用于不同产地半枝莲中这四种黄酮类化合物的含量测定，用以判定药材质量。

1 仪器与试药

1.1 仪 器

Agilent 1260 Infinity高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱；TB-215D电子分析天平，丹佛仪器有限公司；EL204电子天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司。

1.2 试 药

野黄芩苷、野黄芩素、木樨草素、芹菜素，均购自青岛捷世康生物科技有限公司。甲酸、甲醇、乙腈为色谱纯，乙醇为分析纯，纯水。半枝莲药材来自四川、山东、江西、江苏、湖南、湖北、河北、安徽、云南9个不同产区，由滨州医学院药学院生药学教研室陈彩云鉴定为唇形科植物半枝莲ScutellariabarbataD.Don的干燥全草。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6×250 mm，5 μm)；流动相：A：甲醇；B：乙腈；C：0.1%甲酸水；梯度洗脱(见表1)；流速：1.0 mL/min，紫外检测波长：335 nm，进样量：10 μL，柱温：30 ℃。

表1 梯度洗脱程序

2.2 标准品溶液

分别称取野黄芩苷标准品、野黄芩素标准品、木樨草素标准品与芹菜素标准品适量，加甲醇制成浓度分别为1.02 mg/mL、0.221 mg/mL、0.205 mg/mL、0.200 mg/mL的标准品混合溶液。

2.3 供试品溶液

半枝莲粉碎后，取药材粉末约0.1 g，置于10 mL带盖EP管中，加50%乙醇水3 mL，充分浸泡后，100 kHz，60 ℃条件下超声60 min(期间每隔5 min剧烈震摇一次，保证药材提取充分)，然后静置至室温，离心后将上清液取出，进样(10 μL)，进行分析。

2.4 系统适用性试验

分别取“2.2”、“2.3”项下制备的对照品溶液和供试品溶液各10 μL，按“2.1”的确定的色谱条件测定。结果供试品中四种黄酮类化合物得到了很好的分离，结果见图1。

图1 四种黄酮类化合物混合标准品(a)和半枝莲样品(b)的HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatogram of mixed standard for four flavonoids(a); scutellaria barbata(b)

2.5 方法学验证

2.5.1 标准曲线与线性关系

将“2.2”配制好的各个浓度的4个化合物标准品的混合溶液，按“2.1”确定的色谱条件进行试验，分别以四个化合物标准品的峰面积为纵坐标，浓度为横坐标建立标准曲线，野黄芩苷、野黄芩素、木樨草素、芹菜素分别在浓度范围10.20～1020 μg/mL、2.21～221 μg/mL、2.05～205 μg/mL、2.00～200 μg/mL内线性关系良好，结果见表2。

表2 标准曲线方程

2.5.2 精密度、稳定性、重复性试验

各取称量半枝莲的粗粉(0.1 g)，按照“2.3”的方法条件下用于精密度、稳定性的考察。考察精密度试验同一天连续进样6次，考察稳定性试验分别于0 min、360 min、720 min、1080 min、1440 min、1800 min、2160 min各进样一次，共进样7次，由见表3可知，4个化合物的色谱峰的保留时间和峰面积的精密度、稳定性RSD值均小于2.0%，表明该方法精密度、稳定性良好。重复性试验取同一称量的半枝莲粗粉(0.1 g)，称取6份，按“2.3”方法制成供试品溶液，分别进样一次。结果4个化合物的色谱峰的保留时间和峰面积的RSD值均小于3.0%，表明该方法重复性良好。结果见表3。

表3 供试品保留时间和峰面积的RSD值

2.5.3 加样回收率

取少量江西半枝莲粗粉6份，精密各称取0.05 g，分别加野黄芩苷、野黄芩素、木樨草素、与芹菜素适量，加50%乙醇3 mL，使上述4个标准品浓度分别为142.1 μg/mL、16.27 μg/mL、5.300 μg/mL、8.730 μg/mL。按“2.3”方法超声提取，测定回收率，结果(见表4)测得回收率都在90.17%～107.4%范围之内，回收率满足样品分析的要求。

表4 加样回收率

2.6 九个不同产地半枝莲中4种黄酮类化合物的含量测定

对九个不同产地半枝莲进行含量测定，结果见表5。结果表明这四种黄酮类化合物在九种不同产地的半枝莲中含量相差很大，其中以山东所产的半枝莲中这四种黄酮类化合物的总量最高，且野黄芩苷在山东产半枝莲中含量最高，野黄芩素在江苏产半枝莲中含量最高，木樨草素，芹菜素在湖南产半枝莲中含量最高。

表5 九个不同产地半枝莲中4种黄酮类化合物含量测定结果

3 结 论

3.1 提取溶剂醇水比的选择

本试验对半枝莲粉末提取溶剂的醇水比进行了考察，分别以1:10、3:7、1:1、7:3、9:1五种溶剂醇水比进行考察，其中醇水比为1:1(50%醇水比)时，四种黄酮类化合物的色谱峰的峰面积最大，所以本试验最终确定50%醇水比为最佳的提取溶剂醇水比。

3.2 物料比的选择

本试验对物料比分别为1:30、1:50两种情况进行研究考察。其中物料比为1:30时，4种黄酮类化合物的色谱峰的峰面积最大，所以本试验最终确定30倍用量的溶剂体积为最佳的提取溶剂用量。

3.3 流动相选择

由于黄酮类物质的极性较大，且4种化合物结构相类似，因此采用梯度洗脱。其中甲醇-乙腈-0.1%甲酸水溶液系统的梯度洗脱效果最好，且各成分的峰都能较好的分离，并有合适的保留时间，所以选择甲醇-乙腈-0.1%甲酸水溶液系统为最终流动相。

3.4 检测波长的选择

335 nm波长出现的色谱峰较多，并且大部分色谱峰吸收最强，因此确定335 nm波长作为检测波长。