两栖类心脏起搏点观察实验中剪断法与传统结扎法的比较*

司子林 李鹏飞 贾昊鑫 刘梅芳

（济宁医学院药学院 山东日照 276826）

1852年德国科学家Stannius（1808—1883）利用两栖类动物心脏向他的同事演示了一个有趣的实验［1-2］。他在腔静脉进入心房处作一结扎（斯氏第一结扎），可使整个心脏停跳于舒张状态，这时只有2 条腔静脉和静脉窦还能搏动,用针尖轻刺心房，可引起心房收缩，心房收缩后心室也发生收缩；用针尖轻刺心室，心室可发生收缩，但是此刺激不能扩散引起心脏其他部分发生收缩［1］。这说明蛙心的收缩最先出现于静脉窦,兴奋从静脉窦传至心房，再从心房传至心室［1，2］。这是人类对于心脏传导系统最早的实验研究。

Stannius 在人们对心脏的传导系统一无所知的年代,利用这个简单的方法证明了心脏兴奋的顺序和兴奋的来源。故此方法被命名为斯氏结扎法（Stannius ligation），并被沿用至今。但在实际教学中发现,斯氏结扎后心房和心室节律恢复率较低，且恢复所需时间较长。采用针刺、直流电刺激及升高温度等方法均不能促进自律性恢复,这与早期的文献报道一致［3］。本文将结扎法改为剪断法，并对2 种方法进行了比较。

1 实验材料和方法

1.1 实验动物和试剂 人工养殖健康蟾蜍,雌、雄不限，体重40～90 g，由济宁医学院日照校区实验动物中心提供。肝素钠注射液（上海第一生化药业有限公司），所用其他试剂均为分析纯。实验所用溶液有2 种，一种是正常任氏液（NaCl 6.50 g、KCl 0.14 g、NaHCO30.20 g、NaH2PO40.01 g、CaCl20.12 g、葡萄糖1.0 g 溶于蒸馏水1 000 mL）,另一种是添加肝素钠的任氏液，肝素钠浓度为10 单位／mL［4］。

1.2 仪器和设备 实验器材包括蛙类手术器械、玻璃培养皿、烧杯、手术用丝线、计时器、BS224S 电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）、HH-S2数显双孔恒温水浴锅（金坛市瑞华仪器有限公司）和ZW-SX 数显恒温平滑肌槽（河北润联科技有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 斯氏结扎法 结扎位置如图1所示。用金属探针捣毁蟾蜍的脑和脊髓，将其固定于蛙板上，打开胸腔，用小镊子将心包膜提起，用眼科剪将心包膜剪开,暴露心脏；用蛙心夹夹住心尖少量组织，提起心脏，在静脉窦与心房间可看到半月形交界线［5］。此半月线为窦房分界线，用眼科镊在主动脉干下方穿线备用。在进行结扎之前记录蟾蜍的初始心率，用玻璃分针将心尖翻向头端，将预先穿入的结扎线在窦房分界处进行斯氏第一结扎，阻断静脉窦和心房之间的传导,心房和心室会停止搏动,用计时器记录心房-心室恢复搏动所需要的时间及恢复后心率。再在房室沟处进行斯氏第二结扎,观察心室恢复搏动所需时间及恢复后心率［5］。

图1 蟾蜍心脏基本结构和斯氏结扎位置示意图

1.3.2 剪断法及其优化 暴露心脏的步骤及后续记录方法同上,剪断法即将结扎步骤改为用手术剪剪断。暴露心脏并记录初始心率后，用蛙心夹夹住心尖少量组织,提起心脏,用手术剪剪取心脏，注意保留完整的静脉窦。心脏离体后立即浸入盛有任氏液的平皿中，使其处于持续搏动状态，用小镊子轻轻抖动心脏，促进心腔内血液排出；第1次剪断沿半月线进行，称为窦-房分割；第2 次剪断沿房室沟进行，称为房-室分割。为进一步优化剪断法的孵育液,笔者观察比较了在任氏液中添加肝素,以及通氧对心率恢复时间和心搏维持时间的影响。对照组孵育液为正常任氏液；肝素组和肝素-通氧组均使用添加10 单位／mL 肝素钠［4］的任氏液,其中肝素-通氧组是利用平滑肌浴槽的给气管通入空气，根据预实验结果，通气速度设定为90 个气泡／min。

1.4 统计学处理 采用PRISM 5.0 软件进行统计学分析。连续变量数据资料以均值±标准误表示，2 个组之间采用t检验进行比较，多组之间采用方差分析。计数结果采用四格表或列联表表示，用卡方独立性检验进行分析。当P＜0.05 时认为有统计学差异。

2 结果

2.1 结扎法与剪断法的比较 对照组采用结扎法，实验组用剪断法。进行斯氏第一结扎或窦-房分割后，40 min 以内心率得以恢复的视为成功；进行斯氏第二结扎或者房-室分割后，20 min 以内心率得以恢复的视为成功。结果表明剪断法的成功率显著高于斯氏结扎法（P＜0.05），剪断法窦-房分割成功率为83.3%,而斯氏结扎第一扎后成功率仅为47.6%（表1）。此外，剪断法心率恢复时间显著短于结扎法（P＜0.01），斯氏结扎法的平均恢复时间为21.0 min，而剪断法仅为3.8 min（表2）。由结果可知,剪断法心率恢复所需时间显著缩短，而成功率显著提高。但是，剪断法的房-室分割成功率与斯氏第二扎成功率无显著性差异（表1）。

表1 剪断法与结扎法成功率的比较

表2 剪断法与结扎法恢复后心率和心率恢复时间的比较

2.2 肝素和通氧对恢复时间和活性时间的影响将窦-房分割后的心脏放入不同的孵育液中记录心率恢复时间，恢复后心率及心搏维持时间。实验结果表明（表3），肝素组心搏持续时间为42.0 min，与对照组30.8 min 相比显著延长（P＜0.01）。但是2个组在恢复后心率及心率恢复时间方面无统计学差异。肝素-通氧组的心搏持续时间为63.8 min，显著长于对照组和肝素组（P＜0.001）。此外,肝素-通氧组恢复后心率明显高于对照组和肝素组（P＜0.05），这表明持续通氧对于维持心肌组织细胞活性有重要意义。

表3 不同条件下窦房分割前后各项指标的比较

3 讨论

斯氏结扎法作为研究两栖类动物心脏起搏点观察最早使用的方法，简便易行，在基础设施薄弱的早期医学及生物学教育中发挥了不可估量的作用。本研究将传统的结扎法改为剪断法，从实验结果可知，剪断法的成功率明显高于结扎法，而且恢复心率时间明显缩短。心肌是一种耗氧量很高的组织，斯氏结扎后心腔不能充盈，心肌处于缺血缺氧状态，导致ATP 不足及代谢产物堆积，影响心肌细胞的起搏和兴奋传导［6-7］。早期有关蛙心的研究也表明，缺氧可显著降低静脉窦、心房和心室的搏动频率［8-9］。所以结扎导致的缺血缺氧可能是蛙心自律性搏动难以恢复的原因之一。剪断法将离体心脏浸入任氏液中，这能缓解心肌缺血缺氧状态，保持组织活性。此外，本研究还发现，在孵育液中添加肝素可延长心率恢复后节律性跳动的时间，这可能与肝素抑制心肌组织内血管发生血液凝固,改善心肌组织缺血缺氧状态有关。结果还显示，向肝素-任氏液中通入空气可进一步显著延长心脏活性维持的时间。本研究表明，剪断法在成功率、心率恢复时间、心搏维持时间等方面明显优于结扎法，值得推广。