冻藏时间对猪肉中肌原纤维蛋白氧化程度的影响

李 倩 尉立刚 杨钰昆 李美萍 郭彩霞

(山西大学生命科学学院，山西 太原 030006)

肉与肉制品是人们日常饮食中必不可少的组成部分。中国是肉类生产及消费大国，2018年猪肉产量超过5 400万t，占肉类总产量的62.7%[1]。低温冻藏由于经济性和便捷性，在肉类工业中应用广泛[2]。然而，低温冻藏时肉类营养成分也会发生改变[3]。

目前，原料肉在贮藏过程中的品质改变已引起国内外相关学者的普遍关注。Vieira等[4]研究发现，冻藏期间原料肉的色泽改变与脂肪氧化显著相关。Bustabad[5]研究了冻藏方式对猪肉和牛肉质量损失的影响，结果表明：风冷贮藏的原料肉质量损失最大。潘君慧等[6]对不同方式冻藏原料肉中蛋白氧化及凝胶特性进行研究，结果发现：冻藏过程中，未真空包装的原料肉中蛋白质更易氧化，保水能力下降更快。吴亮亮等[7]研究表明，煮制时间对羊肉样品的剪切力有显著影响。李升升等[8]研究发现，随着牦牛年龄的增加，牦牛肉的食用品质明显下降。以上研究均表明加工、蒸煮时间和保存方式等对原料肉品质会有不同程度的影响，其原理仍有待探究。已有研究多集中在原料肉冻藏过程中脂肪氧化、凝胶特性及肉类品质等方面，而关于冻藏不同时间的猪肉中肌原纤维蛋白的变化情况及其相关性研究尚未见报道。

试验拟以新鲜猪肉为原料，-18 ℃下贮藏0，1，4，8，12周，考察冻藏时间对原料肉中蛋白羰基、总巯基、自由氨基、表面疏水性和内源性色氨酸荧光等指标的影响，以期为原料猪肉冻藏过程中理化性质的改变提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

猪里脊肉：市售；

2,4-二硝基苯肼(DNPH)、三氯醋酸(TCA)：分析纯，天津市光复精细化工研究所；

5-5'-二硫代二硝基苯甲酸盐(DTNB)、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)：纯度≥98%，上海易恩化学技术有限公司；

十二烷基硫酸钠(SDS，纯度95%)、盐酸胍(纯度≥98.0%)、牛血清蛋白(BSA，纯度97%)、L-亮氨酸(纯度≥98.0%)：北京索莱宝科技有限公司；

1-苯胺基-8-萘基磺酸盐(ANS)：纯度97.0%，上海贤鼎生物科技有限公司；

2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)：纯度5%，北京百泰克生物技术有限公司。

1.1.2 仪器与设备

pH计：STARTER2100型，奥豪斯仪器(上海)有限公司；

紫外—可见光谱仪：UV-2550型，日本日立公司；

电子天平：JA1203N型，上海精密科学仪器有限公司；

涡旋混合器：QT-1型，上海琪特分析仪器有限公司；

水浴锅：HHS-21-6型，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；

搅拌机：MJ-WBL2501B型，广东美的生活电器制造有限公司；

离心机：HC-3018R型，安徽中科中佳科学仪器有限公司；

荧光分光光度计：LS-55型，珀金埃尔默仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料猪肉的贮藏 将猪里脊肉于4 ℃下剔除肉眼可见的脂肪(白肉)，切割成20 g左右的肉块，保鲜袋包装后于-18 ℃冰箱中存放备用。

1.2.2 肌原纤维蛋白的提取 根据文献[6]修改如下：将1.2.1中原料肉于4 ℃解冻，并分割成均匀的条状，按1∶4 (g/mL)的比例加入磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，搅拌机中充分搅拌(搅拌4次，停顿3次，每次搅拌15 s，停顿5 s)，于4 ℃、2 000×g离心15 min，弃上清液，重复上述步骤3次，随后按1∶4 (g/mL)比例加入NaCl溶液(0.1 mol/L)，充分搅拌，调节pH至6.25，用100目纱布过滤，离心，弃上清液，得肌原纤维蛋白。以牛血清蛋白(BSA)为标准蛋白，利用双缩脲法对上述肌原纤维蛋白浓度进行测定。

1.2.3 羰基含量的测定 根据文献[9]修改如下：取800 μL 浓度为20～40 mg/mL的蛋白溶液，加入8 mL DNPH(10 mmol/L)，避光反应1 h，每隔10 min使用涡旋仪均匀样品。随后加入8 mL 20% TCA沉淀蛋白。4 ℃、5 000×g离心10 min，弃上清液，加入16 mL洗色液(乙醇与乙酸乙酯体积比1∶1)，捣碎沉淀，静置10 min。清洗沉淀3次，弃上清液，吹干样品，加入6 mol/L 盐酸胍6 mL，于50 ℃水浴30 min，以2 mol/L HCl做空白，370 nm比色。按式(1)计算羰基含量。

(1)

式中：

B——羰基含量，nmol/mg·Pro；

A——吸光度值；

ε——摩尔消光系数，22 400 L/(mol·cm)；

C——蛋白浓度，mg/mL。

1.2.4 总巯基含量的测定 根据文献[10-11]修改如下：取1 mL蛋白稀释液于试管中(浓度约为2.0 mg/mL)，加入8 mol/L尿素和3% SDS(以0.1 mol/L磷酸盐缓冲液为溶剂)4 mL，充分混匀，随后加入10 mmol/L DTNB溶液1 mL，涡旋振荡30 s后室温避光反应15 min，以磷酸盐缓冲液做空白，测定412 nm处吸光度值。按式(2)计算总巯基含量。

(2)

式中：

S——总巯基含量，nmol/mg·Pro；

A——412 nm处吸光度值；

D——稀释倍数；

C——蛋白浓度，mg/mL。

1.2.5 自由氨基含量的测定 根据文献[12]修改如下：准确吸取0.2 mL蛋白溶液(浓度为4 mg/mL)，依次加入2 mL 1% SDS和1 mL 0.01% TNBS，充分振荡后，于50 ℃ 水浴30 min(避光)，加入0.1 mol/L Na2SO3溶液2 mL 终止反应，迅速冷却至室温，以蒸馏水为空白，420 nm 处比色，通过L-亮氨酸标准曲线(y=1.041x+0.016，R2=0.99)确定样品中自由氨基含量。

1.2.6 蛋白质疏水性含量的测定 根据文献[10]修改如下：制备浓度为0.04，0.08，0.15，0.30，0.60 mg/mL的蛋白液(稀释溶剂为含0.6 mol/L NaCl的0.1 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 6.25)，取4 mL稀释液，用稀释溶剂作为空白，加入20 μL 8.0 mmol/L ANS溶液(溶解于pH 7.0的0.1 mmol/L磷酸盐缓冲液)，然后涡旋震荡10 s，避光反应10 min。测定时仪器参数设置为狭缝宽度5 nm，激发波长392 nm，发射波长492 nm，并在分析数据的过程中扣除空白对照。用荧光强度对溶液的蛋白浓度作图后所获得的斜率来表示表面疏水指数。

1.2.7 内源性色氨酸荧光的测定 根据文献[13]修改如下：用1.2.6的方法将蛋白溶液浓度稀释至0.4 mg/mL，利用荧光分光光度计进行测定，仪器参数为狭缝宽度5 nm，激发波长279 nm，304.5～460.0 nm的发射光谱。在分析数据的过程中扣除稀释溶剂的发射光谱，以排除试验过程中所产生的干扰。

1.2.8 数据统计分析 所有试验均平行3次，采用Statistix 9.0软件进行方差分析和显著性分析(LSD法)，字母不同表示差异显著(P<0.05)，使用SPSS 20软件进行相关性分析。采用Origin 8.5软件绘图。

2 结果与分析

2.1 对肌原纤维蛋白羰基含量的影响

由图1可知，肌原纤维蛋白中羰基含量随贮藏时间的延长而升高。羰基初始含量为0.25 nmol/mg·Pro，贮藏12周后羰基含量显著升高(0.56 nmol/mg·Pro)，说明低温冻藏环境下，蛋白质氧化程度随贮藏时间的延长逐渐升高。Lund等[14]研究发现脂肪氧化所产生的活性氧自由基或氢过氧自由基在一定程度上可诱导蛋白质发生氧化，导致肉品体系品质下降。因此，低温冻藏期间原料肉中的脂肪氧化可能是导致肌原纤维蛋白氧化的原因。

图1 贮藏时间对肌原纤维蛋白中羰基含量的影响Figure 1 Effects of storage time on carbonyls of myofibrillar protein

2.2 对肌原纤维蛋白总巯基含量的影响

由图2可知，贮藏1周后，总巯基含量显著下降(P<0.05)。随着贮藏时间的延长(4，8周)，总巯基含量未见明显变化。贮藏12周后，总巯基含量下降显著(P<0.05)，降至(40.93±4.36) nmol/mg·Pro。因此，经12周低温冻藏后，肌原纤维蛋白中总巯基含量整体呈下降趋势。Xiong等[15]研究发现氧化体系中的总巯基可氧化为—S—S—，促使肌原纤维蛋白发生分子内交联，导致肌原纤维蛋白质进一步聚集和沉淀，溶解度下降。Morzel等[16]发现肌球蛋白中总巯基对氧化条件较为敏感，在氧化条件下可转化为-S-S-，从而诱导蛋白质发生聚合。因此，随着冻藏时间的延长，肌原纤维蛋白发生氧化可能是导致总巯基含量下降的直接原因。

图2 贮藏时间对肌原纤维蛋白中总巯基含量的影响Figure 2 Effects of storage time on the total sulfhydryl levels of myofibrillar protein

2.3 对肌原纤维蛋白自由氨基含量的影响

由图3可知，贮藏1周后，自由氨基含量下降，但无显著性差异(P>0.05)。贮藏12周后自由氨基含量降至63.14 nmol/mg·Pro，下降趋势显著(P<0.05)。因此，肌原纤维蛋白中的自由氨基含量随贮藏时间的延长逐渐降低。李春强等[17]研究发现，随着氧化时间和氧化程度的增加，自由氨基和巯基含量显著降低，而二硫键含量显著增加；SDS-PAGE结果也表明有大量高分子聚集体生成，因此，自由氨基含量下降可能是肌原蛋白氧化导致蛋白质发生聚集，阻碍了自由氨基的暴露。

图3 贮藏时间对肌原纤维蛋白中自由氨基含量的影响Figure 3 Effects of storage time on free amines of myofibrillar protein

2.4 对肌原纤维蛋白表面疏水性的影响

由图4可知，新鲜原料肉中表面疏水性为282.01，贮藏1周后表面疏水性无显著变化(P>0.05)，贮藏4周后表面疏水性显著下降(P<0.05)。因此，肌原纤维蛋白中表面疏水性随贮藏时间的延长整体呈下降趋势。刘宝华等[18]研究发现，蛋白氧化程度随储藏时间的延长显著升高，部分蛋白质发生聚集，疏水性氨基酸被包埋在蛋白质分子内部从而使蛋白质的表面疏水性下降。曹云刚等[13]研究表明，随着蛋白质氧化程度的加深，肌原纤维蛋白的结构逐渐展开，使得原先存在于蛋白质内部的疏水基团发生一定程度的暴露，疏水相互作用在一定程度上促使疏水基团聚集，导致蛋白质表面疏水性降低。因此，随着冻藏时间的延长，蛋白质结构发生改变，导致蛋白质发生交联聚集，可能是肌原纤维蛋白表面疏水性下降的原因。

图4 贮藏时间对肌原纤维蛋白中表面疏水性含量的影响Figure 4 Effects of storage time on the surface hydrophobicity of myofibrillar protein

2.5 对肌原纤维蛋白内源性色氨酸荧光含量的影响

内源性色氨酸荧光能够表示蛋白质中氨基酸残基及其微环境的变化，进而表征对蛋白结构的影响。由图5 可知，肌原纤维蛋白中内源性色氨酸荧光含量随贮藏时间的延长显著降低。李玲等[19]研究表明：羟自由基氧化可降低内源性色氨酸荧光强度；色氨酸主要存在于蛋白质内部的疏水结构中，由于羟自由基攻击蛋白质肽链，导致肌原纤维蛋白的结构展开，蛋白质分子表面的色氨酸残基增多，致使被激发的内源性色氨酸荧光强度降低。因此，内源性色氨酸荧光强度下降可能是由低温冻藏使蛋白结构展开导致的。

2.6 相关性分析

由表1可知，贮藏时间与羰基含量呈正相关，与总巯基、自由氨基、表面疏水性含量呈负相关，且相关性极显著(P<0.01)；羰基含量与总巯基、自由氨基、表面疏水性含量极显著负相关(P<0.01)；总巯基含量与自由氨基含量显著正相关(P<0.05)；自由氨基含量与表面疏水性含量极显著正相关(P<0.01)。进一步表明原料猪肉在低温冻藏过程中，肌原纤维蛋白的氧化程度随贮藏时间的延长逐渐加深。

图5 贮藏时间对肌原纤维蛋白中内源性色氨酸荧光含量的影响Figure 5 Effects of storage time on the fluorescence spectroscopy of endogenous tryptophan of myofibrillar protein

表1 各指标相关性分析†Table 1 Correlation analysis of each index

† *表示差异显著，P<0.05；**表示差异极显著，P<0.01。

3 结论

试验主要研究冷冻贮藏时间对原料猪肉中肌原纤维蛋白氧化程度的影响及其相关性。结果表明：随着冻藏时间的延长，肌原纤维蛋白中羰基含量逐渐上升，总巯基、自由氨基、内源性色氨酸荧光、表面疏水性含量总体呈下降趋势。相关性分析表明：随着冷冻贮藏时间的增加，肌原纤维蛋白的氧化程度加深。因此，即使在低温冻藏环境下仍不能阻止原料肉中的肌原纤维蛋白氧化，贮藏时间越长，肌原纤维蛋白氧化程度越深，原料肉品质下降愈明显。