植酸酶及其应用前景(综述)(续2)

张相鑫 译自Applied Biochemistry and Microbiology，Vol.54(2018)，№4：352～360

唐彩琰 校

4 获得高科技的新型植酸酶

开发新型高效植酸酶制剂的主要要求与它们的活性有关，包括较宽的有效pH范围、热稳定和耐蛋白酶水解等。因此，有人认为应从能在极端条件下生存的生物中寻找新的植酸酶生产者，或基因修饰先前研究过的能够生产植酸酶的生物，以便改善植酸酶的特性。在研究了生长在火山、温泉和沙漠地区的微生物所生产的植酸酶后，研究人员发现了新的热稳定性植酸酶。芽孢杆菌ZJ0702株和医学环状杆菌分泌的植酸酶热稳定性最高，这些酶可在90 ℃～100 ℃的环境中保持活性。从喜马拉雅地区土壤中分离到的草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)EUFR-3株生产的植酸酶具有较高的活性，可在较宽的pH(pH3～8)范围下保持稳定，并在pH为7.0和温度为40 ℃时表现出最大的活性。这些特性使草酸青霉菌EUFR-3株生产的植酸酶在食品工业中有广泛的应用前景。

利用宏基因组测序技术分析从不同生态系统中分离到的植酸酶的序列以及它们在大肠杆菌中的表达情况，使获得具有不同最适pH范围的热稳定性植酸酶成为可能。这些植酸酶有望在动物生产中得到应用。

黑曲霉菌和烟曲霉菌生产的PhyA植酸酶最早得到广泛研究，是可用于动物生产的植酸酶之一。通过位点特异性诱变替代某些氨基酸，研究人员改善了植酸酶的热稳定性和最佳pH。这些研究还揭示了会影响植酸酶特性的最重要位点。P257氨基酸残基位于连接芽孢杆菌合成蛋白的两个β-层的环上，其会影响这种生理活动的可塑性和该植酸酶的热稳定性。这种效应与其他氢键的形成以及该环表面的P257氨基酸残基有关。利用位点特异性诱变在分离自槌状颗粒菌的植酸酶的催化中心附近增加4个新的二硫键，可提高该植酸酶的热稳定性，且不会影响酶的活性。

研究人员在黑曲霉菌中表达了烟曲霉菌的PhyA基因，从而获得了第一个重组植酸酶。该重组植酸酶具有较高的热稳定性，且可在较宽的pH范围内保持活性。长期以来，人们一直用大肠杆菌培养物获得包括植酸酶在内的重组蛋白。胞外蛋白质的表达可以防止蛋白质在细胞内聚集，免受宿主蛋白酶的水解，从而提高蛋白质的产量。研究人员利用大肠杆菌培养物获得了芽孢杆菌MD2株的胞外热稳定性植酸酶，表明培养条件会显著影响植酸酶的产量。在氯化钙存在的条件下，重组植酸酶的活性显著提高。研究表明，地衣芽孢杆菌PB-13株的植酸酶基因在大肠杆菌BL21株中表达后获得的重组植酸酶rPhyB13 BBP在pH为4～8和温度为80 ℃的环境中仍有活性，且可抵抗胰蛋白酶的水解。

试验表明，选择的宿主会影响重组酶的产量和特性。例如，研究表明，如果将真菌细胞用作重组植酸酶的生产者，可以提高蛋白质的糖基化水平。大肠杆菌appA植酸酶基因在巴斯德毕赤酵母菌中表达后可生产大量的重组蛋白，而通过替代对应的核苷酸进行N-糖基化位点靶向修饰获得不同糖基化水平的AppA植酸酶。在蛋白质糖基化水平较高的三个突变体中，只有一个突变体被证明具有较高的热稳定性和植酸亲和力。此外，对由该突变体合成的植酸酶晶体结构进行研究后发现，该植酸的催化活性和热稳定性与该蛋白α-结构域的可塑性变化有关。

枯草芽孢杆菌植酸酶基因在巴斯德毕赤酵母菌中的表达会提高所产生的蛋白质的糖基化水平和热稳定性，而该植酸酶最适宜的pH范围和温度没有改变。组氨酸酸性磷酸酶(Histidine Acidic Phosphatase，HAP)糖基化会提高酶在酸性条件下的稳定性，并可保护蛋白质免受胃蛋白酶的水解。为了获得志贺氏菌CD2株的重组植酸酶，研究人员用巴斯德毕赤酵母代替大肠杆菌使得酶的热稳定性提高。嗜热侧孢霉菌的植酸酶基因在巴斯德毕赤酵母菌中的表达可明显提高目标产物的产量。在巴斯德毕赤酵母菌甘油醛-3-磷酸(Glyceraldehyde-3-Phosphate，GAP)脱氢酶的组成型启动子中导入一个密码子，可使重组嗜热侧孢霉菌胞外rStPhy植酸酶的产量提高40倍以上。GAP的使用使研究人员能够消除甲醇诱导的弊端。

提高植酸酶效率的另一种方法是将该酶固定在壳聚糖、修饰型ZnO或Fe3O4的纳米颗粒表面。应用这种方法可提高植酸酶的热稳定性和pH稳定性，也可对金属离子产生抗性。将大肠杆菌的植酸酶吸附在发酵芽孢杆菌孢子表面，也可提高植酸酶的热稳定性。

5 植酸酶的工业应用

工业化生产的植酸酶被广泛用于家禽、猪和水产动物的养殖。在饲料中添加植酸酶可提高动物对磷和蛋白质的吸收率，促进动物的能量代谢，同时可减少动物对磷酸盐添加剂的需求量，从而可改善生态条件。

人类自1991年起开始对植酸酶进行工业化生产，当时德国巴斯夫(BASF)公司研发出利用黑曲霉菌生产植酸酶的方法。目前，植酸酶制剂主要由数十家公司生产，除巴斯夫公司外，还有美国的杜邦公司和诺伟思国际公司、丹麦的丹尼斯克动物营养公司和诺维信公司、英国的英联食品公司、保加利亚的浩卫制药公司以及印度的高端酶技术公司等。

已进行商品化推广应用的植酸酶制剂主要是3-植酸酶和6-植酸酶。3-植酸酶来源于真菌(曲霉属和青霉属等)，6-植酸酶来源于细菌[大肠杆菌(E. coli)和布氏柠檬酸杆菌等]。用于畜禽生产的商用6-植酸酶制剂于2003年上市，研究证明该植酸酶具有更强的水解植酸的能力。这些植酸酶的优点是它们在动物胃肠道的酸性和碱性环境中都具有活性、热稳定性和对蛋白酶的抗性。

与真菌源性植酸酶相比，使用细菌源性植酸酶可以提高动物的生产力，并使动物产品的主要生产成本降低20%。丹麦丹尼斯克公司的Fayzym植酸酶、保加利亚浩卫制药公司的Khostazym植酸酶和荷兰帝斯曼公司的Rhonozym植酸酶等植酸酶产品都是6-植酸酶。2013年，美国市场上出现了以布丘菌属(肠杆菌科)的细菌为代表生产的植酸酶。这些植酸酶制剂在pH较低的环境中仍有活性。植酸酶制剂对饲料中植酸的水解效果和所需剂量取决于饲料的组成和植酸酶制剂的生产工艺。饲料含高水平的钙可能会显著降低植酸酶对植酸的水解效果。

植酸酶在美国和西欧各国已得到广泛的应用，这些国家的应用方法被认为是植酸酶的行业标准。近年来，植酸酶在中国、印度和东南亚地区被越来越多地用作饲料添加剂。在俄罗斯，植酸酶制剂的使用还不是特别普遍。然而，畜禽养殖业的发展、经济上的可行性以及生态保护力度的加强都刺激着植酸酶的推广应用。在俄罗斯，只有69种含植酸酶的饲料添加剂被批准用于动物生产。这些饲料添加剂主要由欧洲制造商提供，如德国巴斯夫公司推出的11种商标名为Natufos的植酸酶产品，丹麦诺维信公司上市的6种商标名为Rhonozym的植酸酶产品，保加利亚标伟特公司提供的10种商标名分别为Kormofit、Khostazym和Optyfos的植酸酶产品。美国、中国和印度分别向俄罗斯推出了2种、10种和 10种植酸酶产品。

Natufos植酸酶制剂含有来自黑曲霉菌的未经基因修饰的植酸酶。Rhonozym HaiFos植酸酶制剂是丹麦诺维信公司利用布氏柠檬酸杆菌生产的，天然活性为10 000 U/g，能承受95 ℃的高温。武汉新华扬生物有限公司利用细菌植酸酶生产了成本低的植酸酶制剂Sunfize，该酶制剂已被俄罗斯多家家禽养殖场如Sverdlovskaya鸡场和Ravis Sosnovskaya鸡场(斯维尔德洛夫斯克地区)使用。

目前，俄罗斯Agroferment公司生产的Agrofit植酸酶正被用作饲料添加剂加入家禽、猪和鱼的饲料中。该植酸酶由没有经过基因修饰的灰青霉菌PhPl-33 BKM F-3867 D株生产。研究表明，Agrofit植酸酶在pH 2.5～7.0范围内有活性，其被制成干燥的颗粒状制剂后，在90 ℃下加热5 min仍有活性。Agrofit植酸酶的活性为5 000 U/g，与其他国家同类产品的活性相当。Agroferment公司还生产Agroxyl酶制剂和Agrocell酶制剂，这些酶制剂除含有植酸酶外，还含有其他酶，如β-葡聚糖酶、蛋白酶、木聚糖酶和纤维素酶等。

饲料去植酸化也可以通过在饲料中添加产植酸酶的非致病性菌株来实现。农业废弃物和工业废料经微生物发酵后植酸的含量会减少，无机磷酸盐的浓度会提高，从而可以提高它们在动物营养中的价值。研究发现，从芝麻根际部分离到的克氏柠檬酸杆菌PM-7株能有效水解小麦幼苗、麦麸、米麸、甘蔗渣、棉籽壳、芝麻粉、芥末粉以及椰肉中的植酸。将用小麦粉、芝麻粉饼和豆奶培养的嗜热链球菌TLR50株用于家禽养殖，可提高饲料的无机磷酸盐、蛋白质和糖的含量，降低植酸的浓度。

通过培育出能够在唾液腺中表达大肠杆菌植酸酶基因(appA基因)的转基因动物，可实现提高植物植酸中磷的吸收率的目的。对小鼠和猪的试验表明，激活转基因动物唾液中的植酸酶，可促进动物对饲料中植酸的吸收，减少动物的磷排放量。另一种可以向动物提供磷酸盐的方法是利用微生物的植酸酶基因获得转基因植物。高活性植酸酶可帮助转基因植物吸收积累在土壤中的植酸。此外，饲用谷物中的高活性植酸酶可导致谷物中的植酸储备量减少。将这些植物用作动物饲料的原料，可促进动物对饲料中植酸磷的吸收。

利用真菌和细菌的植酸酶基因可培育出转基因植物。表达PhyA基因或appA基因的欧洲油菜可在只有植酸盐作为唯一磷源的条件下生长，能够提供较高的生物产量，同时还会提高种子中植酸酶的活性，降低植酸的浓度。为了找出含有高活性植酸酶的植物，研究人员还对烟草、大豆、小麦、甘薯和油菜进行了试验。结果表明，这些转基因植物在生长期间以植酸盐为磷源，能将胞外植酸酶分泌到植物的根际部。转基因植物根际部释放出的胞外植酸酶会提高可供植物利用的磷的水平，也为邻近的植物创造了有利的生长条件。值得注意的是，植物在实验室无菌土壤中表达植酸酶基因所产生的影响要比其在自然环境的更显著。这显然是植酸酶被排放到环境后迅速丧失活性造成的。

下调控制植酸合成最后阶段的基因会降低转基因水稻中植酸的浓度，同时提高无机磷酸盐的含量。该突变不会影响种子的生长或发芽。

为了降低土壤中不易被植物吸收的植酸的水平，相关研究人员正在利用细菌植酸酶或含有高活性植酸酶的微生物(生物肥料)开发其他方法。为了实现这一目标，需要筛选出合适的土壤微生物作为生物肥料。

植酸酶也可用于工业和农业的其他领域。在纸浆和造纸行业中，将植酸酶用作具有木聚糖酶活性的未纯化的或技术级的酶制剂的组成部分，能够减少有毒化合物的形成，改善生态环境。众所周知，从化学结构上来说有机磷杀虫剂是一类亚磷酸酯，它们的毒性作用与抑制乙酰胆碱酯酶的活性有关。植酸酶能有效地降解有机磷杀虫剂，如氯磷、单溴磷和甲基对硫磷。

植酸酶反应中形成的植酸衍生物在医学上得到了广泛的应用。肌醇可参与细胞信号传导。它在脂质代谢中发挥着重要的作用，可降低糖尿病和肿瘤的发生风险。

植酸酶广泛应用于人类生活的各个领域。当前，植酸酶在畜禽和水产动物养殖上的应用不仅能产生可观的经济效益，而且能保护生态安全。研发和引进新型植酸酶制剂，可为我们提供有利于生态安全的农业技术和工业技术。

(续完)