喉鳞状细胞癌中MTA2的表达及预后分析

刘玉东，甄 娟，韩晓丽，郭明丽

喉癌是耳鼻咽喉科最常见的恶性肿瘤之一，超过90%的喉癌为普通型喉鳞状细胞癌(简称喉鳞状细胞癌)，占人类恶性肿瘤的5%，近年来其发病率有逐渐上升的趋势，严重威胁患者的身体健康。尽管手术、放化疗有了巨大的进展，然而患者的长期预后仍较差，过去的几十年里其5年生存率仅略微提高，喉鳞状细胞癌向周围组织浸润和转移是导致其治疗效果差、预后不良的主要因素，直接影响患者的生存率[1]。因此，识别与鉴定喉鳞状细胞癌转移相关的标志物有助于肿瘤生物学行为的预测和患者的预后判断，并尽早制定治疗策略以延长患者的生存时间。随着分子生物学的发展，国内外研究发现一种肿瘤转移相关基因(mta)家族，其成员mta2基因编码转移相关蛋白2(metastasis-associated protein 2, MTA2)参与多种恶性肿瘤的发生、发展和转移，目前已发现在乳腺癌[2]、胃癌[3]、胰腺癌[4]、肺癌[5]等组织中作为潜在的促癌基因发挥生物学作用，然而其在喉鳞状细胞癌中的报道较少。本实验旨在探讨MTA2在喉鳞状细胞癌中的表达及临床意义，分析其与喉鳞状细胞癌患者5年生存期的关系，并为评估喉鳞状细胞癌进展及患者预后提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料河北省人民医院2009～2018年耳鼻咽喉头颈外科手术切除的120例喉组织标本(包括癌旁正常喉组织30例，高级别鳞状上皮内病变30例，喉鳞状细胞癌60例)，所有患者均为原发，术前均未接受放、化疗。标本经HE常规染色后分别由两名病理医师明确诊断。术中均留取喉组织，其中喉鳞状细胞癌患者手术时一并留取癌旁组织(距离癌组织>1 cm)，所有组织离体后立即取部分放入液氮后移入-70 ℃冰箱保存，以备Western blot检测。

1.2 免疫组化免疫组化SP试剂盒和DAB显色试剂均购自福州迈新公司，MTA2鼠单克隆抗体(sc-55566)购自美国Santa Cruz公司。免疫组化染色采用SP法，以PBS代替一抗作为阴性对照，用已知阳性切片作阳性对照。MTA2蛋白以细胞核呈棕黄色颗粒为阳性显色。MTA2蛋白阳性标准采用阳性细胞百分比和细胞着色强度判断。按阳性细胞百分比计分：无阳性细胞为0分、≤10%为1分、11%～50%为2分，51%～80%为3分、>80%为4分；按细胞着色强度计分：无着色为0分、浅黄色为1分、棕黄色为2分、黄褐色为3分。上述两者相乘作为最终结果：<3分为阴性、≥3分为阳性。

1.3 Western blot检测在收集的新鲜组织内加入裂解液充分裂解，低温高速离心(4 ℃，15 000 r/min，30 min)，提取上清为总蛋白。上样蛋白量为120 μg。电泳(12%SDS-PAGE凝胶)、转印至PVDF膜、封闭，一抗MTA2(1 ∶150)和β-actin(1 ∶200)4 ℃孵育过夜，与相应二抗室温下孵育2 h，ECL发光，经自动电泳凝胶成像分析仪采集图像，分析特异性条带的光密度值，将β-actin光密度值作为内参照，对目的蛋白(MTA2蛋白)的相对表达量进行分析。实验至少重复3次，取平均值。

1.4 随访对所有喉鳞状细胞癌患者术后进行定期随访，随访以接受手术始，截至日期为2018年12月31日。随访采用门诊、电话以及患者复查，平均每3～6个月随访1次，以患者死亡时间止，中途失访者的终止时间为最后1次随访，亦纳入生存分析，统计满5年随访时间的患者共35例进行生存分析。

2 结果

2.1 MTA2蛋白在喉组织中的表达免疫组化结果显示，MTA2蛋白阳性主要定位于细胞核，正常喉组织(6.67%，2/30)、高级别鳞状上皮内病变组织(43.33%，13/30)和喉鳞状细胞癌组织(73.33%，44/60)中MTA2的阳性率逐渐升高，差异有统计学意义(χ2=36.11，P<0.001，图1)。这提示MTA2在喉鳞状细胞癌癌变过程中作为肿瘤促进因子发挥生物学作用。MTA2表达与喉鳞状细胞癌组织学分级(P=0.030)、临床分期(P=0.019)和淋巴结转移(P=0.007)呈正相关，提示MTA2可能与肿瘤的进展和侵袭转移相关，而与患者性别、年龄及肿瘤部位无关(P均>0.05，表1)。

ABC图1 MTA2在喉组织中的表达,SP法:A.正常喉组织;B.高级别鳞状上皮内病变;C.喉鳞状细胞癌

表1 喉鳞状细胞癌临床病理学特征与MTA2表达的关系

*P<0.05

2.2 MTA2在喉鳞状细胞癌组织中高表达Western blot结果显示，MTA2在正常喉组织(0.98±0.07)、高级别鳞状上皮内病变组织(1.30±0.07)和喉鳞状细胞癌组织(1.46±0.11)中的相对表达量依次升高，差异有统计学意义(F=121.194，P<0.001，图2)。

图2 MTA2在喉组织中的表达：1.正常喉组织；2.高级别鳞状上皮内病变组织；3.喉鳞状细胞癌组织

2.3 生存分析随访5年的患者35例(包括5例删失患者)纳入生存分析。MTA2阳性患者存活2例，死亡19例，5年累积生存率9.52%(2/21)，MTA2阴性患者存活9例，死亡5例，5年累积生存率64.29%(9/14)，MTA2阳性者比阴性者生存率明显降低(χ2=11.689，P=0.001)；MTA2阳性患者平均生存时间为25个月，中位生存时间19个月，MTA2阴性患者平均生存时间为50个月，中位生存时间为60个月，MTA2阳性患者平均生存时间和中位生存时间显著低于阴性患者(χ2=10.190，P=0.001，表2，图3)。对喉鳞状细胞癌患者生存时间的单因素分析结果表明，MTA2表达、临床分期、淋巴结转移与患者的生存时间相关(P均<0.05，表2)。将单因素分析中存在统计学差异的变量纳入Cox多变量回归分析，结果表明MTA2表达(HR=2.616)、临床分期(HR=4.131)、淋巴结转移(HR=3.851)均是喉鳞状细胞癌的危险因素(P均<0.05)，MTA2是喉鳞状细胞癌患者预后的独立影响因素之一(表3)。

3 讨论

头颈部肿瘤是全球第5常见的恶性肿瘤，每年新发病例超过50万例，其中有90%源自黏膜鳞状细胞，而且是头颈部鳞状细胞癌。其中喉鳞状细胞癌是仅次于肺癌的第二常见呼吸道黏膜鳞状细胞肿瘤。我国东北地区是喉鳞状细胞癌的高发区。过去的10年中我国喉鳞状细胞癌的发病率呈上升趋势，尤其是超过一半的喉鳞状细胞癌患者在诊断时已为晚期(即Ⅲ+Ⅳ期)，已经出现复发或远处转移，这些患者中只有10%～44%可被治愈；而喉鳞状细胞癌的早期阶段仅通过局部治疗就能治愈85%～95%的患者[6-7]。因此探讨与喉鳞状细胞癌早期诊断和转移相关的肿瘤标志物，对其治疗具有重要意义。

表2 喉鳞状细胞癌患者总生存期的单因素分析

*P<0.05

表3 喉鳞状细胞癌患者总生存期的多因素分析

*P<0.05

图3 喉鳞状细胞癌临床病理特征与患者总生存率的关系：A.MTA2表达；B.临床分期；C.淋巴结转移(LN)

MTA2蛋白与MTA1蛋白有65%的同源性，N端高度相似，但C端的不同之处在于MTA2蛋白缺少myb区和SH3结合区。人mta2基因定位于染色体11ql2-13.1，含18个外显子，启动子位于350 bp，编码的MTA2蛋白相对分子质量约7.0×104，由668个氨基酸组成，含4个不同的结构域：1个BAH结构域(1～144 AA)、1个E1M2结构域(145～256 AA)、1个SANT结构域(263～315 AA)和1个非典型的GATA的锌指结构域(367～394 AA)。MTA2通过这些结构域连接到由组蛋白去乙酰酶(HDAC)、核小体重构及脱乙酰基酶(NURD)形成的复合体从而发挥生物学作用[8-9]。研究证实[10]MTA2在恶性肿瘤和其对应正常组织中的表达存在差异，在同种肿瘤中有淋巴结转移和无淋巴结转移的表达存在差异。Jiang等[11]研究发现MTA2在胃癌组织中的表达明显高于癌旁正常胃组织，并且T3+T4期胃癌组织中MTA2表达明显高于T1+T2期，有淋巴结转移胃癌组织中MTA2的表达高于无淋巴结转移组，表明MTA2可能影响胃癌细胞的局部侵袭及淋巴结转移。Wu等[12]研究发现MTA2在鼻咽癌细胞系中表达增高，过表达MTA2促进鼻咽癌细胞的增殖和侵袭能力；干扰MTA2表达后，出现相反的结果，同时MTA2在鼻咽癌组织中高表达，并且与鼻咽癌组织学分级和淋巴结转移密切相关，上述研究结果提示mta2是一个潜在的促癌基因。本组Western blot结果显示从正常喉组织到高级别鳞状上皮内病变组织到喉鳞状细胞癌组织中的MTA2蛋白表达量逐渐增加，差异有统计学意义；免疫组化结果亦发现MTA2蛋白的阳性率在喉鳞状细胞癌癌变过程中逐渐升高，差异有统计学意义，与Western blot结果一致；可由此推测MTA2在喉鳞状细胞癌的发生、发展过程中起着促进作用。同时统计学分析显示喉鳞状细胞癌组织中MTA2表达随着临床分期和病理学分级的增高而增加，且与淋巴结转移呈正相关，提示MTA2可能与喉鳞状细胞癌的进展和转移等生物学行为密切相关。

Ding等[13]研究发现MTA2蛋白与结肠癌组织学分级密切相关，通过生存分析发现MTA2高表达结肠癌患者的生存率明显低于MTA2低表达者。甄娟等[14]在卵巢癌中的研究发现，与MTA2低表达患者比较，MTA2高表达患者的存活时间明显缩短，多因素回归分析提示MTA2蛋白为卵巢癌有效的独立预后指标，MTA2有可能成为判断恶性肿瘤进展及患者预后的新分子学标志物。那么，在喉鳞状细胞癌中MTA2蛋白表达与患者预后存在怎样的关系呢？本实验经Kaplan-Meier生存曲线分析，MTA2蛋白阳性患者比阴性患者的5年生存率及生存时间明显缩短，两组患者生存曲线的分布差异有统计学意义。文献报道人乳头状瘤病毒(human papilloma virus, HPV)是喉乳头状瘤的病原体，HPV 16/18可能在喉鳞状细胞癌的发生中起一定作用，也有部分观点认为HPV在喉鳞状细胞癌中的作用被夸大[15]，因此本实验将常见的临床病理特征列入单因素及多因素分析，结果提示MTA2蛋白表达、临床分期及淋巴结转移与患者的5年生存率和生存时间有关，MTA2表达缺失、淋巴结转移阴性、临床分期越早，患者的生存时间越长；多因素分析结果提示，MTA2蛋白表达、临床分期及淋巴结转移均为喉鳞状细胞癌的危险因素，表明MTA2是喉鳞状细胞癌患者有效的预后预测指标，这与上文提及的MTA2可作为判断结肠癌、胰腺癌预后的独立危险因素一致，推测MTA2对喉鳞状细胞癌也具有一定的预后评价作用。

总之，本实验结果表明，MTA2可能在喉鳞状细胞癌发生、发展和转移过程中发挥重要作用；MTA2具有成为喉鳞状细胞癌诊断和治疗靶点的潜能，可以作为患者预后的预测因素，然而本实验只是初步的验证，MTA2参与喉鳞状细胞癌的的进展及转移的具体机制有待进一步分析。HPV在喉鳞状细胞癌发生中的作用也有待我们进一步证实。