低浓度苯和甲醛经呼吸道联合染毒对小鼠雌性生殖毒性的影响

邹丽君，高艳芳，贺印旎2，张娟，胡恭华

(1. 赣南医学院基础医学院，江西 赣州 341000；2. 邵阳学院生物遗传教研室，湖南 邵阳 422000)

苯和甲醛作为常见的工业原料在各行各业中应用广泛，成为典型的职业环境污染物和室内空气污染物[1]，引发的健康问题也成为国内外学者的研究热点。苯和甲醛均是人类确认的致癌物，两种毒物共同暴露可导致造血系统、神经系统、生殖系统等多种健康损害[2-4]。其中雌性生殖功能损害涉及亲子两代、毒作用表现更复杂，尤其低浓度苯和甲醛于卵泡发育期的联合暴露导致对雌性小鼠的生殖功能损害的研究较少。本文拟通过对卵泡发育期ICR小鼠进行低浓度苯和甲醛的联合暴露来探讨苯和甲醛的雌性生殖毒性，为苯和甲醛的生殖毒性评价提供参考线索和实验基础。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级雌性ICR小鼠108只，平均体重26.56 g，SPF级雄性ICR小鼠27只，平均体重28.75 g[购自湖南斯克景达实验有限公司，生产许可证号：SCXK(湘)2016-0002，使用许可证编号SYXK(赣)2018-0004)]。屏障环境饲养和染毒，温度为18℃～24℃，湿度为40%～60%。

1.2仪器和试剂 55 L静式染毒柜(实验室自制，塑料材质、可密封、透明)，Sorvall ST 8R型高速冷冻式离心机(美国Thermo Fisher)，EON-EPOCH酶标仪(美国Biotek)，ZXDP-R2800电热恒温培养箱(上海智城)，玻璃匀浆器；苯(分析纯，国药集团)，37%甲醛水溶液(分析纯，国药集团)，0.01 M PBS缓存液，SOD和MDA试剂盒(南京建成)，FSH和LH酶联免疫试剂盒(武汉华美)。

1.3实验方法

1.3.1分组和染毒 将108只SPF级雌性ICR小鼠采用两个因素、三个剂量水平(32)的析因设计进行随机分组，苯和甲醛各三个剂量水平分别为：0 mg/m3、12 mg/m3、60 mg/m3和0 mg/m3、2 mg/m3、10 mg/m3，共有9个不同染毒组，每组12只。呼吸道静式染毒，于雌鼠卵泡发育期连续染毒14 d，2 h/d(中间间隔1 h)。染毒期间禁食禁水，其余时间自由饮水摄食，每7 d测量一次体重。染毒第13 d、14 d清晨连续2 d采用普通光学显微镜观察雌鼠阴道分泌物的方法判定雌鼠的动情周期，筛选动情期的雌鼠于染毒结束处死并采集生物标本进行指标检测，每组满足6只，剩余雌鼠与雄鼠按2∶1的比例进行持续3 d的合笼交配再分笼饲养至雌鼠产下仔鼠、喂养4 d后处理全部动物。

1.3.2雌鼠体重的称量 经呼吸道14 d染毒期间每7 d测量一次体重，后续继续交配并产仔的雌鼠每7 d测量一次体重。

1.3.3雌鼠动情周期的判定 染毒第13 d、14 d清晨7：00对所有染毒雌鼠进行阴道分泌物涂片检查以判定动情周期，第13 d筛选动情前期动物，筛选标准为镜下有核上皮细胞占多、少量自细胞和角质化上皮细胞，第14 d筛选动情期动物，筛选标准为镜下大量角质化上皮细胞、典型样本呈落叶状。通过连续2 d对雌鼠动情周期的判定以保证染毒结束时处死的雌鼠均同步在动情期，雌鼠性激素水平具有可比性，每组满足6只。

1.3.4雌鼠脏器系数的计算 染毒结束时筛选动情期的雌鼠采血后处死并解剖分离心、肝、脾、肾、子宫、卵巢，小心剪除结缔组织后于PBS缓冲液冲洗血污，滤纸吸干后快速在电子天平上称量并记录。

1.3.5雌鼠子宫组织超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量测定 染毒结束时将筛选动情期的雌鼠处死，解剖分离子宫，称量约0.1 g子宫组织与PBS缓冲液按1∶9用玻璃匀浆器制备10%子宫匀浆，10 min 3000 r/min离心，取上清液按照南京建成试剂盒的说明书测定和计算子宫组织SOD活力和MDA含量。

1.3.6雌鼠血清卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)含量测定 染毒结束时筛选动情期雌鼠进行10%水合氯醛麻醉后摘眼球取血，5 min 2000 r/min离心分离血清，按照武汉华美酶联免疫试剂盒的说明书测定和计算FSH和LH含量。

1.3.7母鼠生育力及胎仔发育毒性判定 观察交配行为及妊娠结局(产仔数、活仔数，每窝平均体重)，计算生育指数、妊娠指数、活产指数和4 d存活指数。生育指数=(与雄鼠交配受孕的雌鼠数/与雄鼠同笼的雌鼠数)×100%，妊娠指数=(正常分娩雌鼠数/妊娠的雌鼠数)×100%，活产指数=(活产胎仔数/胎仔总数)×100%，4 d存活指数=(哺乳4 d存活仔鼠数/活产胎仔总数)×100%。

2 结果

2.1苯和甲醛联合染毒14 d雌鼠体重变化情况 苯不同剂量组雌鼠体重增长不同，差异有统计学意义(P<0.05)，甲醛不同剂量组的体重增长呈现剂量越高增长越缓慢趋势，但差异无统计学意义，苯和甲醛联合染毒对雌鼠的体重增长有交互作用，有统计学意义(P<0.05)，表现为低剂量联合组体重增长较少(G6组平均体重增长为1.68 g)，高剂量联合组体重增长较多(G9组平均体重增长为2.95 g)。合笼交配产仔的孕鼠因受孕时间有先后，受孕后的体重变化无法同步，组间和组内的体重变化虽有记录但缺乏可比性。见表1、表2。

表1 苯和甲醛联合染毒14 d雌鼠体重变化情况

表2 各组雌鼠体重变化方差分析结果

2.2苯和甲醛联合染毒14 d对雌鼠脏器系数的影响 各处理组的心脏系数、肝脏系数、子宫系数的差异无统计学意义，无主效应及交互作用；苯不同剂量组和甲醛不同剂量组的脾脏系数的差异有统计学意义(P<0.05)，无交互作用；苯不同剂量组的肾脏系数、卵巢系数的差异无统计学意义，甲醛不同剂量组的肾脏系数、卵巢系数差异有统计学意义(P<0.05)，无交互作用。见表3、表4

表3 苯和甲醛联合染毒14 d对雌鼠脏器系数的影响

表4 各组雌鼠脏器系数方差分析结果

2.3苯和甲醛联合染毒14 d对雌鼠子宫组织SOD活力和MDA含量的影响 苯不同剂量组和甲醛不同剂量组的子宫组织SOD活力的差异有统计学意义(P<0.05)，无交互作用；甲醛不同剂量组的子宫组织MDA含量的差异有统计学意义(P<0.05)，苯和甲醛联合染毒对雌鼠子宫组织MDA含量有交互作用，有统计学意义(P<0.05)，表现为低剂量联合组升高较少(G6组平均MDA含量为6.50 nmol/mg prot)，高剂量联合组升高较多(G9组平均MDA含量为7.79 nmol/mg prot)，但均低于高剂量甲醛组(G5组平均MDA含量为9.04 nmol/mg prot)。见表5、表6。

表5 苯和甲醛联合染毒14 d对雌鼠子宫组织SOD活力和MDA含量的影响

2.4苯和甲醛联合染毒14 d对雌鼠血清FSH和LH的影响 苯和甲醛单独染毒对雌鼠血清FSH无主效应，苯和甲醛联合染毒对雌鼠血清FSH有交互作用，有统计学意义(P<0.05)，表现为低剂量联合组升高较多(G6组平均FSH为64.52 mIU/ml)，高剂量联合组升高较少(G9组平均FSH为54.85 mIU/ml)。各处理组的LH差异无统计学意义，无主效应及交互作用。见表7、表8。

表6 各组雌鼠子宫组织SOD活力和MDA含量方差分析结果

表7 苯和甲醛联合染毒14 d对雌鼠血清FSH和LH的影响

表8 各组雌鼠血清FSH和LH方差分析结果

2.6苯和甲醛联合染毒14 d对雌鼠生育力和胎仔发育的影响 苯和甲醛单独染毒时低剂量组的生育指数均低于高剂量组，而低剂量组的妊娠指数均高于高剂量组，苯和甲醛低剂量联合组的生育指数高、妊娠指数低，高剂量联合组的生育指数低、妊娠指数高；苯不同剂量组的产仔数、活仔数、活仔重、4 d存活指数及4 d活仔重差异无统计学意义，甲醛不同剂量组的产仔数、活仔数、活仔重、4 d存活指数及4 d活仔重差异有统计学意义(P<0.05)，苯和甲醛联合染毒的14 d存活指数、4 d活仔重有交互作用，有统计学意义(P<0.05)，表现为低剂量联合组降低(G6组平均4 d存活指数为93.60%及4 d活仔平均重为2.33 g)，高剂量联合组升高(G9组平均4 d存活指数为100.00%及4 d活仔平均重为2.61 g)。见表9、表10、表11。

表9 苯和甲醛联合染毒14 d对雌鼠生育力的影响

表10 苯和甲醛联合染毒14 d对胎仔发育的影响

表11 各组胎仔发育方差分析结果

3 讨论

苯和甲醛作为人类确认的致癌物和致突变物，经常联合暴露于职业环境和室内环境，如化工行业中用于原料生产各类化工产品、作为溶剂和助剂用于喷漆印刷行业和家居装修材料等。职业流行病学调查显示职业环境苯暴露可导致女工月经紊乱，增加自然流产率，降低女性生育能力[5-6]，对新装修居室的人群进行流行病学调查也发现女性生殖功能损害与居室环境的苯和甲醛暴露相关[7]。随着国家职业卫生标准和环境卫生标准的推广实施，职业环境和室内环境中苯和甲醛的暴露通常在较低的水平，在这种情况下，两者是否存在联合作用、其生殖损害呈现何种特征是一个新的命题。

本次研究采用两个因素、三个剂量水平(32)的析因设计对卵泡发育期的ICR雌鼠进行单独染毒和联合染毒，苯和甲醛各三个剂量水平分别为：0 mg/m3、12 mg/m3、60 mg/m3和0 mg/m3、2 mg/m3、10 mg/m3，连续染毒14 d，基本覆盖雌鼠3个动情周期，以确保交配时排出的卵子都存在毒物暴露，染毒结束后每组筛选6只动情期的动物检测性激素等指标，每组其他雌鼠继续观察交配分娩产仔等生殖毒性终点。本研究的设计特点有：①依据职业环境和室内环境低浓度、联合暴露的情况，采用低浓度苯(12 mg/m3、60 mg/m3)和甲醛(2 mg/m3、10 mg/m3)联合暴露，分析两种毒物单独染毒的毒效应及联合染毒的毒效应，为职业和环境卫生评价提供参考；②与传统胚胎植入期、器官形成期染毒不同，本次研究选择卵泡发育期进行雌性动物染毒，染毒后即雌雄交配，毒物作用于卵细胞的发育过程，为育龄期女性生殖功能损害提供参考；③实验观察的终点涉及亲子两代，既有母鼠的系统毒性、生育力，又有胎仔的发育毒性，从亲子两代阐述毒物的生殖损害，为苯和甲醛的生殖毒性评价提供参考。

体重是反映机体系统毒性的重要指标，从染毒期间雌鼠体重变化的析因分析结果来看，苯不同剂量组雌鼠体重增长不同，差异有统计学意义，甲醛不同剂量组的体重增长无统计学意义，苯和甲醛联合染毒对雌鼠的体重增长有交互作用，表现为低剂量联合组体重增长较少，高剂量联合组体重增长较多，说明该剂量下的苯对小鼠体重的影响要高于甲醛，联合染毒时甲醛的暴露抵消了苯对体重的影响。动物脏器系数的改变为确定毒作用的靶器官提供线索。从实验结果来看，14 d短时间、低浓度的苯暴露对脾脏系数有一定影响，提示该剂量下的苯对造血系统有损害，而甲醛不同剂量组的脾脏、肾脏、卵巢系数的差异有统计学意义，提示卵巢可能是甲醛导致生殖损害的靶器官，结合中医方面的补肾养血方治疗卵巢储备功能下降的临床实践[8]及建立早发性卵巢功能不全肾虚血瘀证的实验动物模型[9]等相关文献，提示甲醛对小鼠生殖损害的作用机制可能涉及因肾脏、脾脏功能不全导致的卵巢储备功能下降，进而影响母鼠的生育力和胎仔的发育。

FSH和LH是反映卵巢储备的重要指标，若卵巢储备功能降低，FSH和FSH/LH比值会升高[10]，广西壮族绝经妇女雌激素受体-β基因多态性与促卵泡刺激素、黄体生成素和雌孕激素的研究也证实α基因组的促卵泡刺激素、黄体生成素明显下调，其临床预后较好[11]，提示促卵泡刺激素与雌性生殖功能负相关。从FSH的变化可以看出，苯和甲醛单独染毒对雌鼠血清FSH无主效应，苯和甲醛联合染毒对雌鼠血清FSH有交互作用，表现为低剂量联合组升高，高剂量联合组降低，说明联合染毒导致的毒效应不同与各毒物单独染毒，低剂量组毒效应高于高剂量组。结合胎仔的胚胎毒性来看，甲醛不同剂量组的产仔数、活仔数、活仔重、4 d存活指数及4 d活仔重不同，低剂量甲醛组低于高剂量甲醛组，苯和甲醛联合染毒时低剂量联合组的4 d存活指数及4 d活仔重也低于高剂量联合组。这一实验结果与李辉等[12]的研究类似，与高剂量甲醛组相比，低剂量甲醛组的胚胎毒性更明显；低剂量联合时毒效应增大，高剂量联合时毒效应相互抵消，4 d存活指数和4 d活仔重都有回升。

综上，低浓度苯(12 mg/m3、60 mg/m3)和甲醛(2 mg/m3、10 mg/m3)联合暴露对ICR小鼠的体重增长有影响，存在系统毒性，结合脏器系数的变化来看，可以推测该剂量下的暴露可导致卵巢等多种脏器的损伤。以往苯和甲醛生殖毒性研究多以雄性动物染毒或孕鼠胚胎植入期、器官形成期染毒，此次我们选择卵泡发育期的ICR雌鼠为实验对象进行呼吸道染毒，外推到人类即为育龄期的职业女工，多以呼吸道接触毒物，又不能享受孕期和哺乳期女工的劳动待遇，而实验结果显示苯和甲醛低浓度、短时间的联合暴露导致的雌性生殖损害既有主效应又有交互作用，提示目前苯与甲醛的职业接触限值对职业女工的生殖健康存在一定风险。从动物实验结果来看，甲醛的生殖损害更明显，多个指标在甲醛不同剂量组有差异，苯和甲醛联合染毒有交互作用，表现为低剂量联合组的毒效应要高于高剂量联合组，可能联合染毒时苯的暴露对甲醛的毒效应存在抵消，但考虑到样本量和实验的稳定性，其交互作用具体为拮抗还是协同作用有待进一步研究。