99Tcm-3PRGD2 SPECT诊断大鼠骨移植瘤

张新超，边艳珠*，国方娜,2，魏 强，胡玉敬，田丛娜，吴大勇，张文艳

(1.河北省人民医院核医学科，河北 石家庄 050051；2.河北工程大学附属医院核医学科，河北 邯郸 056002)

整合素是一种介导细胞与细胞之间或细胞与外环境之间的跨膜受体蛋白，广泛参与传递细胞信号和调节细胞周期。整合素受体αⅤβ3是整合素家族的重要成员，在恶性肿瘤细胞或新生血管内皮细胞膜上高表达，而在正常组织或已存在血管内皮细胞上不表达或表达极低[1-5]。基于此生物学特性，整合素受体αⅤβ3有望成为诊断和评估恶性肿瘤的特异性分子靶点[5]。联肼尼克酰胺-3聚乙二醇-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸环肽二聚体(3 polyethylene-glycol Arg-Gly-Asp dimer, 3PRGD2)是一类多肽类衍生物，对肿瘤细胞及新生血管内皮细胞表面的整合素受体αⅤβ3具有高度亲和力，对于诊断肿瘤具有较高特异性。临床试验[6]已证实可采用99锝m-3PRGD2(99Tcm-3PRGD2)显像诊断肺癌和乳腺癌等，而诊断骨转移瘤的相关报道[7]较少。本研究通过99Tcm-3PRGD2SPECT对大鼠骨移植瘤显像，探讨其诊断骨转移瘤的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取5只健康清洁级雌性Wistar大鼠，体质量140～160 g，30只健康清洁级雌性Wistar大鼠，体质量220～250 g，均购自河北医科大学实验动物中心(合格证编号：SCXK 2016-0002)。本研究经河北省人民医院动物伦理委员会批准。

1.2 动物分组与建模 向5只体质量140～160 g雌性Wistar大鼠腹腔内接种复苏后Walker-256大鼠乳腺癌细胞(河北医科大学动物实验中心)用于増殖细胞，待7～10天大鼠腹部明显隆起后，抽取大鼠棕黄色浓稠腹腔积液置于无菌离心管，以1 000 r/min离心 3 min后弃去上清液，加入适量0.9%无菌生理盐水，在显微镜下观察细胞形态，并在细胞计数板上计数肿瘤细胞数，调整细胞浓度至1.0×108/ml。将30只体质量220～250 g雌性Wistar大鼠随机分为实验组(n=20)和对照组(n=10)。以10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠后，于左后肢胫骨距胫股关节面1.5 cm处钻取约1 mm2小孔，采用微量注射器于骨髓腔内分别注入5 μl活性腹腔积液混悬液(实验组，约5.0×105个肿瘤细胞)[8-9]及煮沸30 min的灭活肿瘤细胞(对照组)。于此后第10、20及30天行大鼠胫骨CT扫描，参数：管电压120 kV，管电流100 mA，矩阵512×512，重建层厚0.625 mm，判断转移瘤模型是否建立成功；成瘤标准[10]：CT示骨髓腔内密度减低区及骨皮质断裂、缺损。

1.3 制备99Tcm-3PRGD2和大鼠SPECT显像 依据文献[11-12]方法制备99Tcm-3PRGD2，并检测其放射化学纯度：将新鲜Na99TcmO4淋洗液浓度调整至 37 MBq/0.1 ml后注入3PRGD2冻干品中，充分震荡摇匀；取99Tcm-3PRGD2与大鼠血清混合于煮沸消毒的安培瓶，并置于37℃水浴锅内，以Waltman滤纸为固定相、丙酮为展开剂，以薄层纸层析法测定混合液1 h、2 h、4 h和6 h的放射化学纯度。采用GE Discovery 670 SPECT/CT仪，探头与大鼠距离约5 cm，能峰 140 keV,窗宽±20%，矩阵128×128，放大倍数1.0，采集时间10 min。建模后第30天经鼠尾静脉注射0.2 ml99Tcm-3PRGD2(74 MBq)，1 h后行SPECT静态平面显像[11]。

1.4 图像分析 采用GE Xeleris后处理软件分析图像，由2名具有10年以上骨肿瘤核医学诊断经验的副主任医师联合阅片，并利用ROI技术计算骨移植瘤部位放射性计数与对侧相应部位同等大小区域的放射性计数比值(target to nontarget ratios, T/NT)，ROI约20 mm2，每只大鼠重复测量5次，取平均值作为最终结果。

1.5 病理学检查 显像结束后断颈处死大鼠，截取左胫骨中上段组织，经冲洗、固定后置于脱钙液中脱钙至少60天[13]，再经梯度乙醇、二甲苯脱水、包埋、切片、干燥后行HE染色，经脱蜡、乙醇梯度水化后行免疫组织化学染色。由2名具有10年以上工作经验的病理科副主任医师在不知晓实验设计的情况下联合阅片，分别观察骨移植瘤及骨组织受侵情况和细胞胞膜、胞浆及血管内皮细胞，呈棕黄色即为整合素αⅤβ3受体阳性细胞。

1.6 统计学分析 采用SPSS 21.0统计分析软件。符合正态分布的计量资料以±s表示。符合正态性分布和方差齐性，以t检验比较2组T/NT。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 建立大鼠乳腺癌骨移植瘤模型 建模后10天内实验组2只大鼠死亡。建模后第10天，左侧胫骨CT于大鼠骨皮质和髓腔内均未见明显密度改变；第20天，10只(10/18)大鼠左侧胫骨髓腔内出现密度减低区；第30天密度减低区范围扩大，并见骨皮质片状缺损或中断，部分大鼠出现跛行；剩余8只大鼠始终未出现骨皮质或髓腔密度改变。对照组大鼠活动自如，均未出现胫骨周围软组织肿胀及跛行，建模第30天CT扫描示左胫骨骨皮质完整，髓腔内密度均匀，未见骨破坏表现。

图1 2组大鼠左侧胫骨骨移植瘤区99Tcm-3PRGD2 SPECT显像(箭示骨移植瘤部位) A.实验组可见显像剂浓聚(箭)；B.对照组未见显像剂浓聚

图2 2组大鼠左侧胫骨移植瘤病理图(×400) A、B.实验组HE染色见大量肿瘤细胞浸润(A)，对照组见大量椭圆形排列规则的骨细胞、未见肿瘤细胞(B)；C、D.实验组αⅤβ3免疫组织化学染色示大量棕黄色的阳性肿瘤细胞(C)，对照组未见阳性细胞(D)

2.299Tcm-3PRGD2放射化学纯度及SPECT显像 标记后的99Tcm-3PRGD2为无色澄清溶液，与血清混合温育1 h、2 h、4 h和6 h后，放射化学纯度分别为97.60%、97.20%、96.10%和95.40%。实验组10只建模成功，SPECT显像示左侧胫骨骨移植瘤区显像剂浓聚(图1A)，平均T/NT为(3.48±0.44)；对照组大鼠左侧胫骨未见显像剂浓聚或少量显像剂增浓(图1B)，平均T/NT为(1.10±0.84)；实验组T/NT比值明显高于对照组(t=16.66,P<0.001)。

2.3 病理学结果 HE染色示实验组大鼠胫骨骨基质结构不完整，周围大量肿瘤细胞浸润，肿瘤细胞中分布不等量红细胞，血管、神经结构消失，哈弗管扩大，骨细胞肿胀、固缩或消失，部分被破骨细胞取代，符合肿瘤表现(图2A)；对照组大鼠胫骨骨皮质结构完整清晰，可见大量排列均匀的哈弗系统，其间见均匀分布的骨陷窝，内见椭圆形骨细胞(图2B)。实验组免疫组织化学染色显示肿瘤细胞及新生血管内皮细胞包膜及包浆上整合素αⅤβ3受体染为棕黄色(图2C)，对照组未见棕黄色肿瘤细胞(图2D)。

3 讨论

整合素是一种介导细胞与细胞之间或细胞与外环境如细胞外基质(extracellular matrix, ECM)之间的跨膜受体蛋白。信号转导过程中，整合素将ECM的化学成分与力学状态等有关信息传入细胞，参与传递细胞信息、调节细胞周期及细胞运动[11]。整合素αⅤβ3是整合素家族的重要成员,与肿瘤血管生成、侵袭和转移关系密切；在正常组织及正常血管内皮细胞内不表达或低表达,而在活动期恶性肿瘤细胞或新生血管内皮细胞呈高表达。能与整合素αⅤβ3受体特异性相结合的分子探针可作为SPECT显像剂，在肿瘤诊断、良恶性鉴别和疗效评估等方面发挥重要作用[5]。

核素标记多肽显像是早期诊断肿瘤的关键。HAUBNER首次将18F标记精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp， RGD)示踪剂用于整合素αⅤβ3受体显像[14]。研究[15-16]证实放射性核素标记的RGD多肽可对肺癌、乳腺癌、甲状腺癌、脑胶质瘤等高表达整合素αⅤβ3受体的肿瘤显像，无创评估肿瘤组织内整合素αⅤβ3受体的表达水平。通过检测整合素αⅤβ3受体表达水平可评估肿瘤良恶性。已有研究[6]报道采用RGD诊断原发肿瘤和评价疗效，但用于骨转移瘤的研究较少。MIAO等[7]发现99Tcm-3PRGD2诊断骨转移瘤的灵敏度、特异度、准确率均高于99锝m-亚甲基二膦酸盐骨显像(99Tcm-MDP)。99Tcm-3PRGD2显像具有高特异度，骨折或退行性改变等良性变病少见显像剂浓聚，故有助于降低假阳性率；其诊断溶骨性病变的灵敏度高，单纯溶骨性病变可见显像剂浓聚；3PRGD2不依赖于无机盐代谢更新速度和成骨细胞活跃程度，而与肿瘤细胞增殖有关，病灶中尚未出现成骨反应时，99Tcm-3PRGD2显像即可见显像剂浓聚[5]。本研究通过复制乳腺癌骨移植瘤大鼠模型模拟恶性肿瘤骨转移，以99Tcm-3PRGD2SPECT进行显像，探讨其诊断骨转移瘤的可行性，结果显示该方法可行，且99Tcm-3PRGD2标记率高，安全性和稳定性均佳。

本研究的主要不足：①骨移植瘤模型成瘤率相对较低；②未与其他影像学方法进行比较，有待进一步完善。

综上所述，99Tcm-3PRGD2易标记，放射化学纯度高，稳定性好；99Tcm-3PRGD2SPECT显像可无创诊断大鼠骨移植瘤，有望为临床诊断骨转移瘤提供新的影像学方法。