培肥措施对复垦土壤微生物碳氮代谢功能多样性的影响

王宇峰，孟会生，李廷亮,2，谢钧宇，栗 丽，李丽娜，黄晓磊

培肥措施对复垦土壤微生物碳氮代谢功能多样性的影响

王宇峰1，孟会生1，李廷亮1,2※，谢钧宇1，栗 丽1，李丽娜1，黄晓磊1

（1. 山西农业大学资源环境学院，太谷 030801；2. 山西农业大学农业资源与环境国家级实验教学示范中心，太谷 030801）

土壤复垦是矿区生态环境恢复和耕地总量平衡及质量提升的根本要求。该研究依托山西襄垣采煤塌陷区定位复垦试验基地，采用Biolog-ECO方法和荧光定量PCR技术，研究了不施肥（CK）、单施化肥（CF）、单施有机肥（M）和有机无机培肥（MCF）4种培肥措施下复垦4 a和8 a土壤微生物碳代谢功能多样性及氮代谢功能基因丰度的变化特征。结果表明：随复垦年限增加，单施有机肥较其他处理可显著提高复垦土壤微生物的总碳源利用能力；不同处理复垦土壤微生物碳源相对利用率从高到低依次为氨基酸类、糖类、聚合物类、羧酸类、双亲化合物类、胺类，其中单施有机肥更大程度上提高了羧酸类、氨基酸类和胺类碳源的利用率；复垦年限和培肥措施没有改变复垦土壤微生物优势度指数，但有机无机配施较其他处理可显著提高香浓指数（）和Pielou均匀度指数；不同处理复垦土壤氮转化功能基因丰度总体从大到小依次表现为（AOA）、（AOB）、、，5种功能基因丰度均为以有机无机培肥处理最高，且随复垦时间增加而增加；复垦土壤有机质含量与基因丰度以及平均颜色变化率（Average Well Color Development, AWCD）值存在显著相关性，相关系数在0.707～0.807，同时5种氮转化功能基因丰度均与玉米产量存在显著或极显著的相关性，相关系数在0.824～0.949。综上所述，单施有机肥可提高土壤有机质含量，进而增强了复垦土壤碳代谢强度，有机无机培肥则更有利于复垦土壤碳氮代谢功能多样性的提升，并促进作物产量形成。

复垦；土壤；微生物；功能多样性；培肥措施

0 引 言

山西省煤炭资源开采为中国改革开放40多年的经济发展做出了巨大贡献，但同时造成了大面积的生态环境破坏。经初步统计，山西省因采煤造成的累积采空面积近5 000 km2，其中沉陷区面积约3 000 km2，沉陷区近40%为耕地[1-2]。矿区土地复垦是当地实现耕地总量动态平衡、缓解人地矛盾的重要途径。土壤培肥熟化是矿区土壤复垦重要内容，复垦土壤质量提升很大程度体现在土壤碳氮库容变化。微生物是土壤生态系统中最活跃的组分，在土壤碳氮循环过程中发挥着重要作用，因此明确复垦土壤微生物碳氮代谢特性可有效评价复垦措施的肥力提升效应。

土壤微生物多样性反应了土壤微生物自身代谢特性以及与土壤环境条件相互作用的多样化程度，土壤微生物多样性与土壤碳氮代谢关系密切，施肥措施通过改变土壤环境条件可进一步影响微生物群落碳氮代谢方式[3-5]。Biolog-ECO法是一种典型解析土壤微生物碳源利用特征，反应土壤微生物群落功能多样性的方法。李猛等[4]对28年定位试验的设施蔬菜地研究表明，长期不同施肥促使土壤微生物群落形成了不同的碳代谢方式，有机肥配施一定量氮肥可有效提高土壤微生物碳源利用能力，且以氨基酸类碳源的利用率最高；何翠翠等[6]对褐土区冬小麦-夏玉米轮作体系的研究表明，有机肥替代50%～100%无机氮肥可以提高土壤微生物碳源利用能力和多样性指数，以糖类碳源的利用率最高；另外在东北黑土[7]、红壤[8]、灰漠土[9]和水稻土[10]等研究均表明，增施有机肥或有机无机配施较单施化肥和不施肥可显著提高土壤微生物对碳源的利用能力及微生物多样性，但不同土壤类型以及不同施肥措施下碳源利用类型存在一定差异。土壤氮素循环对土壤氮库固存与氮素供应起着协调平衡作用，土壤氮代谢功能基因丰度与土壤氮素循环密切相关，目前有关氮转化功能基因研究多关注于固氮作用的基因，硝化作用过程中氨氧化细菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）的基因以及反硝化作用过程中、、基因[11-13]。施用有机肥或有机无机配施较单施化肥可提高土壤AOA和AOB的基因丰度[14-15]；长期施用无机氮肥可降低黑土、棕壤AOA的基因丰度，但随施氮量增加提高了土壤中AOB的基因丰度[16-18]；另外Sun等[19]和Li等[20]研究表明施用有机肥可以增加酸性土壤中、AOA-、AOB-、、和等多个氮转化功能基因丰度，不同施肥措施下均以基因对氮转化微生物群落多样性贡献率最高，且基因较其他功能基因对施肥具有更高的敏感性。矿区复垦土壤由于土体重构，土壤结构性、养分资源库以及微生物区系都处于初级演化阶段，其理化生物学性状必然不同于传统农田土壤。土壤微生物是表征土壤质量变化最敏感性指标，有关复垦土壤微生物多样性研究对揭示土壤形成演化过程以及建立土壤快速培肥理论均具有重要意义。以往有关矿区复垦土壤的研究多集中在土壤结构性及养分利用方面[21-22]，而有关不同培肥措施下土壤微生物多样性随复垦时间变化特征的研究则系统性不强，因此本研究基于长期定位试验基地，具体研究不同培肥措施下复垦土壤微生物碳氮代谢功能多样性变化特征，以期为矿区复垦土壤质量提升提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

长期定位试验基地位于山西省襄垣县（36°28′11.95′′N，113°00′ 52.57′′E），海拔980 m，属于暖温带半湿润大陆性季风气候，年平均气温9.5 ℃，年均降水量530 mm，无霜期为160 d。土壤类型为石灰性褐土。基地有复垦年限A和复垦年限B的试验田，复垦年限A试验田于2008年开始采用混推复垦方式平整恢复土地，2009年起通过不同施肥措施培肥土壤；复垦年限B试验田于2013年同样采用混推复垦方式平整恢复土地，并进行土壤培肥。

1.2 试验设计

试验田A和B试验处理设置相同，包括4个培肥处理：1）不施肥（CK）；2）单施化肥（CF）；3）单施有机肥（M）；4）50%有机肥+50%化肥（MCF）。其中氮肥为尿素（含N 46%），磷肥为过磷酸钙（含P2O512%），钾肥为硫酸钾（含K2O 50%），有机肥为腐熟的鸡粪，含N 1.68%、P2O51.54%，K2O 0.82%，各施肥处理养分投入量相同，具体见表1。每个处理设置3个重复，采用随机区组设计，小区面积为100 m2。试验区一年一作种植春玉米，每年5月播种，10月收获，玉米秸秆全部粉碎翻压还田。

表1 不同施肥处理的肥料用量

注：CK，CF，M和MCF分别表示不施肥对照、单施化肥、单施有机肥、有机无机配施处理，下同。

Note: CK, CF, M and MCF mean no-fertilizer control, chemical fertilizers only, manure only and 50% chemical fertilizers co-applied with 50% manure, respectively. Same as below.

1.3 样品采集与指标测定

于2017年4月春玉米播种前，利用五点法采集每个试验小区耕层（0～20cm）土壤混合样品，分别得到复垦4 a（试验田B）和复垦8 a（试验田A）土壤样品。同时采集周边未复垦的撂荒生土（RS）和未破坏农民多年种植的熟土（US）作为土壤培肥效果参照。一部分样品过2 mm筛，放入灭菌塑料袋中，用冰盒运回实验室，4 ℃保存，尽快完成土壤微生物碳氮代谢功能多样性测定；一部分新鲜土壤样品过2 mm筛，测定土壤硝态氮；剩余土壤样品自然风干后，分别1 mm筛和0.149 mm筛，测定土壤速效磷、速效钾和有机质；2016年10月试验田玉米产量采用全区收获计产。

1.3.1 土壤微生物碳代谢功能多样性测定

采用Biolog-ECO分析微生物群落功能多样性[10,23]，Biolog-ECO含有6类31种碳源。称取10 g（当量质量）鲜土于250 mL三角瓶中，加入90 mL灭菌的0.85 mol/LNaCl溶液，以200 r/min振荡30 min，取一定量上清液用0.85 mol/LNaCl溶液多级稀释至1 000倍，静置10 min后，向ECO板培养基孔中加入150L稀释液，每个样品做3次重复。将接种好的微孔板放入25 ℃恒温培养箱中，分别于24、48、72、96、120、144、168、192、216和240 h使用ELxS08-Biolog微孔板读数仪（Bio-Tek Instruments Inc，美国）读取在590 nm（颜色+浊度）和750 nm（浊度）波长下的吸光度。微生物代谢活性用590 nm下的吸光度值减去750 nm 下的吸光度值表示，其中数值小于0.06时按0处理。

式中C为第个非对照孔的吸光值；为对照孔的吸光值；为培养基碳源种类数（31）。

Shannon-Wiener多样性指数

Simpson优势度指数

McIntosh 指数

式中n是第孔的相对吸光值（C-）。

Pielou 均匀度指数

式中为被利用的碳源总数。

微生物对碳源的相对利用率（%）=（6）

式中AWCD为第种碳源的平均颜色变化率；AWCD为所有样品处理6类碳源中平均颜色变化率最大值。

丰富度指数，指被利用的碳源总数目，本研究中为每孔中（C-）的值大于0.25的孔数。

1.3.2 土壤微生物氮代谢功能多样性测定

首选使用Fast DNA® Spin Kit for Soil（MP Bio，Santa Ana，CA，美国）提取各土壤样品DNA，经1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量后，使用NanoDrop2000（Thermo Fisher，Waltham，MA，美国）测定DNA浓度和纯度。然后使用荧光定量PCR仪（ABI 7500 Thermocycler，Applied Biosystems, California, 美国）测定各样品的氮代谢功能基因丰度，包括与硝化作用相关的基因（包括AOA和AOB），与反硝化作用相关的、基因以及固氮细菌的基因，进而评价土壤微生物氮代谢功能多样性。

5种功能基因的qPCR扩增体系均为：土壤微生物总DNA 1L，正反向引物各1L，TaKaRa TB Green™ Premix Ex Taq™ II 12.5L，加ddH2O补足至25L。不同氮代谢功能基因的特异性引物及其qPCR反应条件见表2。扩增过程中，分别以含有目标功能基因的重组pMD19-T载体为标准质粒，并按 10倍浓度稀释梯度构建标准曲线。上述5种氮代谢功能基因扩增曲线的2值均大于0.99。

表2 基因扩增引物及其反应条件

1.3.3 土壤养分含量测定

土壤硝态氮采用 1mol/LKCI浸提，流动分析仪测定[28]；有机质采用重铬酸钾容量法测定[29]；土壤速效磷采用0.5 mol/L NaHCO3浸提，钼锑抗比色法测定[29]；速效钾采用1 mol/LNH4OAC浸提，火焰光度法测定[29]。

1.4 数据处理

试验数据使用Microsoft Excel 2016整理，利用SPSS20.0软件进行作图和检验统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理复垦土壤微生物的碳源利用特征

复垦土壤微生物对碳源利用的AWCD值随培养时间延长逐渐增加（图1），自24 h起迅速增加，168h后呈缓慢增加状态。复垦4 a土壤，不同处理间AWCD值从高到低依次为MCF、 M、CF、CK，除CK处理外，其余3个培肥处理AWCD值较周边撂荒（AS）土壤均有不同程度增加。复垦8 a土壤，不同处理间AWCD值从高到低则依次为M、MCF、CF、CK，进一步方差分析表明，M处理AWCD值自96 h起显著高于其他处理，但其最大值较周边农田熟土（US）仍低19.5%（<0.05），MCF、CF和CK处理相对于复垦4 a土壤AWCD值无显著提升，且CF处理的增加幅度低于CK处理。

对不同处理复垦土壤培养168 h的6类碳源相对利用率分析表明（表3），土壤微生物碳源相对利用效率从高到低依次为氨基酸类、糖类、聚合物类、羧酸类、双亲化合物类、胺类，其中胺类和双亲化合物类的相对利用率低于50%。经过4 a培肥复垦，不同施肥处理土壤微生物对糖类、双亲化合物类碳源利用差异不显著，但M和MCF处理较CF和CK处理相对提高了聚合物类、羧酸类、氨基酸类和胺类碳源的利用率，且高于撂荒土壤相应碳源利用率。经过8 a培肥复垦，CF较CK处理显著降低了双亲化合物类碳源利用率，其余5类碳源差异不显著。M和MCF相对于CF处理显著提高了聚合物类、羧酸类、氨基酸类、胺类和双亲化合物类碳源利用率，其中M处理更大程度地提高了羧酸类、氨基酸类和胺类碳源的利用率，但其中氨基酸类和胺类碳源利用率较周边农田熟土仍低20%左右。

注：US和AS分别表示周边未破坏农田熟土和撂荒生土，下同。

表3 复垦土壤微生物对6类碳源的相对利用率

注：同一列后不同小写字母表示各施肥处理在0.05水平差异显著，下同。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant differences in fertilizer treatments (< 0.05). Same as below.

2.2 不同处理复垦土壤微生物的多样性指数分析

不同培肥处理复垦土壤微生物的香浓指数、优势度指数、McIntosh指数、丰富度指数及Pielou均匀度指数见表4。其中香浓指数和Pielou均匀度指数变化趋势一致，复垦8 a土壤总体高于复垦4 a土壤，不同处理间均以MCF处理最高，且复垦8 a土壤下MCF处理的Shannon-wiener指数和Pielou均匀度指数接近于周边未破坏农田熟土水平，较撂荒生土分别高28.6%和27.8%，同时显著高于其他培肥处理。不同复垦年度和培肥处理下土壤微生物优势度指数无显著变化，以及与撂荒地和农田熟土之间亦无明显差异，均值为0.95。McIntosh指数和丰富度指数均以M和MCF处理最高，显著高于CF和CK处理，但M和MCF处理之间差异不显著。各培肥处理的McIntosh指数随复垦年限增加总体提升，而丰富度指数则对复垦年限无明显响应。同时由表4可知，CF和CK处理之间的5个多样性指数无显著差异。

表4 不同培肥措施复垦土壤中微生物多样性指数

2.3 不同处理复垦土壤微生物功能多样性的主成分和聚类分析

对不同处理复垦土壤培养168 h各碳源的AWCD值进行主成分分析，得到特征值大于1的主成分6个，第1主成分（PC1）至第6主成分（PC6）方差贡献率分别为41.1%、25.4%、14.1%、5.6%、4.8%和3.4%，累积贡献率为94.4%，本研究选取前3个主成分进行分析。31种碳源在前3个主成分中的因子载荷值（表5）可以反映主成分与碳源利用的相关程度，绝对值越大表示该碳源对主成分的影响越大，意味着处理之间该碳源利用率差异性越大。本研究中PC1载荷值绝对值>0.7的有14种，其中包括糖类5种（I-赤藻糖醇，D-甘露醇，N-乙酰基-D-葡萄胺，D-纤维二糖，a-D-乳糖），氨基酸4种（L-精氨酸，L-天冬酰胺酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸），聚合物类（a-环状糊精）1种，胺类（苯乙基胺）1种，D-半乳糖醛酸在内的羧酸类3种。其余PC2和PC3载荷值绝对值 >0.7的共有7种，其中包括糖类1种，氨基酸类1种，聚合物类1种，羧酸类4种。进一步Q型聚类分析表明（图 2），若分为4类，US为1类，AS为1类，8-M为1类，其余为1类，这与上述6类碳源利用和多样性指数变化趋势相近。

注：4、8表示复垦时间，a。

表5 31种碳源的因子载荷

2.4 不同处理复垦土壤微生物氮代谢功能基因丰度分析

复垦土壤5种功能基因丰度总体表现从大到小依依为为（AOA）、（AOB）、、（表6），初步推测复垦土壤氮循环过程中硝化作用强于反硝化作用，并优于固氮作用。随复垦年限增加，土壤中5种功能基因丰度均呈增加趋势，复垦8 a土壤AOA和AOB 的基因拷贝数分别较复垦4 a土壤增加0.70～3.92倍和0.76～3.06倍，和基因拷贝数分别增加0.57～1.01倍和1.10～2.15倍，基因拷贝数增加了0.29～0.93倍，以AOA和AOB 的基因增加幅度最大。不同培肥处理间5种功能基因丰度均表现为MCF > M > CF> CK，且差异达显著水平。复垦8 a的MCF处理各基因拷贝数接近或高于周边未破坏农田熟土水平。

表6 不同培肥措施对复垦土壤氮代谢功能基因丰度的影响

2.5 不同处理复垦土壤养分含量、玉米产量及其与微生物碳氮代谢多样性相关性分析

表7是不同培肥处理下复垦土壤养分含量及玉米产量情况。可知，经过4～8 a培肥，采煤塌陷复垦土壤各养分含量较周边撂荒（AS）土壤均有明显提升，其中复垦8 a土壤的有机质、硝态氮、速效磷和速效钾较复垦4 a土壤分别平均提高了16.9%、33.2%、63.8%和3.0%。同一复垦年限，不同培肥处理间土壤有机质、速效磷和速效钾均以M处理最高，而硝态氮则以CF处理最高。复垦8 a土壤的玉米产量较复垦4 a土壤增加了17%～46%，不同处理间玉米产量从大到小依次为MCF、M、CF、CK，且差异达显著水平。进一步相关性分析表明（表8），土壤有机质含量与反应微生物碳代谢多样性的AWCD值存在显著相关性，相关系数达0.807，且土壤有机质含量与反硝化基因和固氮基因丰度亦存在显著相关性，相关系数在0.707～0.766，另外土壤5种氮转化功能基因丰度均与玉米产量存在显著或极显著的相关性，相关系数在0.824～0.949。

表7 不同培肥措施对复垦土壤养分含量及玉米产量的影响

表8 复垦土壤微生碳氮代谢多样性与土壤养分及玉米产量的相关性

注（Note）：*< 0.05; **< 0.01.

3 讨 论

平均颜色变化率（AWCD）表征土壤微生物群落对不同碳源利用的差异性，反映了土壤微生物活性和微生物群落生理功能多样性。本研究中，各培肥处理的AWCD值在培养168 h后呈缓慢上升状态，其中有机无机配施和单施有机肥处理的AWCD值总体高于单施化肥和对照处理，随复垦年限增加，单施有机肥处理较其他处理显著提高了AWCD值。表明施用有机肥可以提高土壤微生物活性和群落多样性，且随时间进程增加，这种促进效应更强，这与前人研究结果一致[6-8]。分析原因认为有机肥的投入一方面为微生物代谢活动提供了丰富的营养物质，另一方也会改变土壤理化性质，优化了土壤微生物生存代谢条件，进而提高土壤微生物群落代谢功能[6,23,30]。本研究进一步分析也表明单施有机肥较其他处理更大程度提高了土壤有机质、速效磷和速效钾含量，且土壤有机质含量与168 h的AWCD值存在显著相关性。

前人大量研究表明增施有机肥或有机无机配施较单施化肥可显著提高土壤微生物的碳源利用能力[7-10]。本研究在相同氮磷钾供应量条件下，也发现单施有机肥和有机无机配施较单施化肥或不施肥整体上提高了采煤塌陷区复垦土壤微生物的碳源相对利用率，其中单施有机肥对部分碳源的利用率相对更高。分析原因认为外源有机肥施用为土壤提供了大量生物有效性碳源以及部分外源菌群，同时新鲜有机碳会产生激发效应，维持比较高的微生物活性[4,6,31]；而长期单施化肥产生的胁迫作用会一定程度上降低土壤细菌和真菌的多样性，进而降低微生物生物量及其生物活性[8,23,32]。

本研究中复垦土壤微生物碳源相对利用效率从高到低依次为氨基酸类、糖类、聚合物类、羧酸类、双亲化合物类、胺类。张婷等[33]和张瑞等[34]在华北潮土区小麦-玉米轮作体系，侯晓杰等[35]在东北棕壤连作玉米体系，以及罗希茜等[36]在稻田土壤上的研究也均显示当地土壤微生物群落利用的主要碳源是氨基酸类和糖类，说明糖类和氨基酸类有机物质是土壤中大多微生物种群的基础代谢物质。然而，不同外源有机肥投入条件下土壤微生物对6种碳源利用嗜好有很大差异，本研究中单施有机肥（腐熟鸡粪）处理土壤微生物对氨基酸类碳源利用率最高，随复垦年限增加，单施有机肥更大程度上提高了氨基酸类、羧酸类和胺类碳源的利用率。刘晶鑫等[7]研究则表明单施马粪处理下土壤微生物对聚合物类碳源利用率最高。郭莹等[10]研究表明低量有机肥投入条件下，发酵猪粪较新鲜猪粪处理土壤微生物对聚合物类和糖类碳源具有较高的利用率；高投入量条件下，发酵猪粪较新鲜猪粪处理土壤微生物对氨基酸类和胺类碳源具有较高的利用率。可见，不同有机肥因组成成分和特性差异，对土壤微生物类群具有一定的定向选择性。另外本研究中，随复垦年限增加，单施化肥处理降低了双亲化合物类碳源利用率，具体原因有待进一步分析。

从微生物多样指数来看，本研究中不同培肥措施改变了土壤微生物群落功能多样性，有机无机配施和单施有机肥较不施肥和单施化肥处理显著提高了McIntosh指数（）和丰富度指数（），另外有机无机配施处理更大程度提高了Shannon-wiener指数（）和Pielou均匀度指数（），表明施用有机肥可以增加土壤微生物生理类群数量和均匀度，其中有机无机配施更有利于土壤微生物多样性的提升，原因可能是化肥配施有机肥为土壤微生物代谢提供了更全面的营养物质，可使得土壤中更多的微生物类群活跃起来。同时本研究也发现，不同复垦年度和培肥处理下土壤微生物Simpson优势度指数（）无显著变化，丰富度指数（）对复垦年限无明显响应，表明不同培肥措施及复垦进程并没有促成土壤微生物群落个别类群的优势分布，且类群丰富度受复垦进程的影响也较小。徐万里等[9]的研究也表明不同施肥措施对土壤Simpson优势度指数（）影响不明显，但也有研究表明单施有机肥或有机无机配施有利于提高土壤微生物群落优势种的优势度[6,35,37]，这可能与投入有机肥的种类及可能带入的微生物类群有关。

本研究中，通过对复垦土壤培养168h各碳源的AWCD值进行主成分因子载荷值的分析，发现不同培肥处理之间碳代谢差异主要集中在5种糖类（I-赤藻糖醇，D-甘露醇，N-乙酰基-D-葡萄胺，D-纤维二糖和a-D-乳糖）和4种氨基酸（L-精氨酸，L-天冬酰胺酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸）。在张婷等[33]的研究中，也表明不同施肥措施下土壤微生物群落代谢特征差异较大，主要体现在D-甘露醇、N-乙酰基-D-葡萄胺、a-D-乳糖、D-纤维二糖、L-天冬酰胺酸和L-苏氨酸，与本研究结果相近。进一步通过聚类分析表明，未复垦撂荒土壤分为1类，周边未破坏农田熟土分为1类，单施有机肥复垦8 a的土壤分为1类，其他培肥措施的复垦土壤分为1类，表明复垦土壤通过多年的有机肥投入已很大程度上改变了土壤碳代谢功能多样性。

功能基因丰度可以间接反应微生物代谢功能强度，本研究表明不同培肥措施下复垦土壤功能基因丰度总体表现为（AOA）>（AOB）>>，初步推测复垦土壤氮循环过程中硝化作用强于反硝化作用，并优于固氮作用。盖霞普[38]在华北平原农田的研究也表明长期增施粪肥会显著增加氨氧化细菌丰度，进而增加了土壤硝化速率。土壤理化特性对土壤氮转化功能基因的分布具有重要影响作用，比如土壤pH是影响硝化过程和反硝化过程的主要因子[18,20,39]。Bossolani等[40]研究发现，酸性土壤施用石灰或石膏可以提高固氮基因丰度，降低硝化基因和反硝化基因丰度。另外本研究中碱性复垦土壤（AOA）基因丰度高于（AOB）基因丰度，而大多数研究表明AOA和AOB生态位分异特征表现为AOA在酸性土壤中占主导优势，而AOB在中性或碱性的环境中起主导作用[41-44]，另外贺纪正等[45]指出氨氧化古菌主要由Group1.1a associated 和Group1.1b 两大类组成，其中Group1.1a associated 主要分布于酸性土壤，Group1.1b 则主要分布于中性及碱性土壤，原因可能是本研究的复垦土壤中氨氧化古菌主要是Group1.1b类群。

本研究中，有机无机培肥处理的5种功能基因丰度均显著高于其他培肥措施。Sun等[19]通过30年的长期定位试验也表明，有机肥配施肥化肥可以提高土壤中（AOA）、（AOB）、和基因丰度。同时本研究表明，随复垦年限增加，5种功能基因丰度均表现为增加趋势，其中以有机无机配施处理的AOA和AOB 的基因增加幅度最大，表明AOA和AOB 的基因对施肥等环境因子较其他功能基因更具敏感性，进一步说明氨氧化作用较固氮作用和反硝化作用对肥料的投入更加敏感，这在Sun等的研究中也有相关报道[19]。另外本研究中，复垦土壤反硝化基因和固氮基因丰度与土壤有机质含量存在显著相关性，相关系数在0.707～0.766，表明化肥配施有机肥通过提升土壤有机质含量，改善了土壤微生物生境条件，进而提高了相关氮转化功能基因丰度。同时本研究发现复垦区玉米籽粒产量与5种功能基因丰度均存在显著或极显著的相关性，表明土壤氮代谢功能强度对作物养分利用和产量形成具有重要的促进作用。

4 结 论

1）采煤塌陷区复垦土壤微生物对碳源的相对利用率从高到低依次为氨基酸类、糖类、聚合物类、羧酸类、双亲化合物类、胺类，连续多年单施有机肥可显著提高复垦土壤微生物的碳源利用能力，且更大程度上提高了羧酸类、氨基酸类和胺类碳源的利用率。不同培肥处理之间微生物碳代谢差异主要集中在5种糖类（I-赤藻糖醇，D-甘露醇，N-乙酰基-D-葡萄胺，D-纤维二糖和a-D-乳糖）和4种氨基酸（L-精氨酸，L-天冬酰胺酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸）。

2）培肥措施和复垦年限均没有改变复垦土壤微生物优势度指数，且丰度度指数对复垦年限亦无明显响应，表明不同培肥措施及复垦进程并没有促成土壤微生物群落个别类群的优势分布，且类群丰富度受复垦进程的影响也较小。有机无机配施较单施有机肥显著提高了土壤微生物Shannon-wiener指数（）和Pielou均匀度指数（）。

3）复垦土壤氮转化功能基因丰度总体从大到小表现为（AOA）、（AOB）、、、，初步推测复垦土壤氮循环过程中硝化作用强于反硝化作用，并优于固氮作用。有机无机配施较其他培肥措施可显著提高5种功能基因丰度，且以AOA和AOB 的基因增加幅度最大，表明AOA和AOB 的基因对施肥等环境因子较其他功能基因更具敏感性。

4）复垦土壤有机质含量与基因丰度以及平均颜色变化率存在显著相关性，同时5种氮转化功能基因丰度均与玉米产量存在显著或极显著的相关性。总体表明，单施有机肥可提高土壤有机质含量，进而增强了复垦土壤碳代谢强度，有机无机培肥则更有利于复垦土壤碳氮代谢功能多样性的提升，并促进作物产量形成。

[1]山西省人民政府办公厅. 山西省深化采煤塌陷区治理规划（2014-2017）[EB/OL]. 2015-03-20[2015-03-20]. http://www.shanxi.gov.cn/sxszfxxgk/sxsrmzfzcbm/sxszfbgt/flfg_7203/bgtgfxwj_7206/201504/t20150413_161431.shtml

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Effects of fertilization regime on the functional diversity of microbial carbon and nitrogen metabolism in reclaimed soil

Wang Yufeng1, Meng Huisheng1, Li Tingliang1,2※, Xie Junyu1, Li Li1, Li Lina1, Huang Xiaolei1

(1,,030801,; 2.,,030801,)

Soil reclamation has become a fundamental requirement for ecological environment restoration, total dynamic balance of cultivated land resources, and soil quality improvement in mining areas. This study was carried out at the long-term reclaimed base of a coal mining subsidence area in Xiangyuan county, Shanxi province, China. Surface soil samples of 0-20 cm were collected under various fertilization regimes in the 4- and 8-year experiment. Biolog-ECO and qPCR technologies were used to investigate the effect of various fertilization regimes on the soil microbial functional diversity of carbon metabolism, and functional gene abundance of nitrogen metabolism. Four fertilization treatments were applied within each reclamation stage, including no fertilizer (CK), chemical fertilizer only (CF), manure only (M), and 50% chemical fertilizers co-applied with 50% manure (MCF). The results showed that the M treatment can significantly improve the ability of soil microorganisms to utilize total carbon sources, compared with other treatments with the increase of reclamation years. The relative utilization rate of microorganism to carbon sources in reclaimed soil under various treatments were successively amino acids, carbohydrate, polymers, carboxylic acids, amine and miscellaneous from high to low. The M treatment improved the utilization rate of carboxylic acids, amino acids, and amines to a greater extent than those of other carbon sources. The differences of microbial carbon metabolism between various fertilizer treatments were mainly concentrated in five kinds of sugars, (including I-Erythritol, D-Mannitol, N-Acetyl-D-glucosamine, D-Cellobiose and α-D-Lactose), and four amino acids (including L-Arginine, L-Asparagine, L-Serine and L-Threonine). No significant change was observed in the Simpson index () under various reclamation years and fertilization regimes, indicating that the fertilization measures and reclamation years did not contribute to the dominant distribution of soil microbial physiological groups. The MCF treatment significantly improved the Shannon-wiener index () and Pielou evenness index (), compared with other treatments. The functional gene abundance of nitrogen conversion was ranked in a descend order:AOAAOB, in the reclaimed soil under various treatments. It infers that the nitrification was stronger than the denitrification and nitrogen fixation in the nitrogen cycle process of reclaimed soil. The abundance of five functional genes in the MCF treatment was the highest than that in other treatments, where increasing with the increase of reclamation time. The increase amplitude ofgene of AOA and AOB was the highest, indicating that the amoA gene was more sensitive than other functional genes to environmental factors, such as fertilization. The content of organic matter was significantly correlated with the abundance of,,genes, and AWCD values in reclaimed soil, where the correlation coefficient was 0.707-0.807. Meanwhile, the abundance of five nitrogen conversion function genes was significantly or extremely significantly correlated with maize yield, where the correlation coefficient was between 0.824-0.949. Single application of manure can significantly increase the content of soil organic matter, and then enhance the intensity of microbial carbon metabolism, while, the combination of manure and chemical fertilizer was more conducive to improve the function diversity of carbon and nitrogen metabolism in reclaimed soil, and thereby to promote the crop yield.

reclamation; soils; microorganism; functional diversity; fertilization regime

王宇峰，孟会生，李廷亮，等. 培肥措施对复垦土壤微生物碳氮代谢功能多样性的影响[J]. 农业工程学报，2020，36(24)：81-90.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.24.010 http://www.tcsae.org

Wang Yufeng, Meng Huisheng, Li Tingliang, et al. Effects of fertilization regime on the functional diversity of microbial carbon and nitrogen metabolism in reclaimed soil[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(24): 81-90. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.24.010 http://www.tcsae.org

2020-07-26

2020-11-18

国家自然科学基金项目（41401342，41807102，U1710255-3）

王宇峰，主要从事土壤肥力与环境方面的研究。Email：luckytll@yeah.net

李廷亮，博士，教授，主要从事土壤肥力与环境方面的研究。Email：litinglaing021@126.com

10.11975/j.issn.1002-6819.2020.24.010

S158.5

A

1002-6819(2020)-24-0081-10