隐匿性乙型肝炎病毒感染的生物学及临床影响的研究进展

王荣明 江建宁

2018年10月，众多国际专家齐聚意大利陶尔米纳参加隐匿性乙型肝炎病毒感染(OBI)研讨会。本次研讨会回顾和讨论了OBI的现有认识，通过小组讨论，所有与会者达成共识，最终提出了2018版OBI声明，本文将简要介绍本次声明的内容。

一、OBI定义

隐匿性乙型肝炎病毒感染(OBI)是指通过目前的检测方法，在乙型肝炎表面抗原(HBsAg)检测阴性者的肝脏和(或)血液中，检测到具有复制能力的HBV DNA(即游离型共价闭合环状DNA，cccDNA)。根据HBV特异性抗体谱，OBI分为：血清阳性OBI——乙型肝炎核心抗体(抗-HBc)和(或)乙型肝炎表面抗体(抗-HBs)阳性；血清阴性OBI——抗-HBc和抗-HBs阴性。研究发现，OBI患者的HBV DNA仅在血清/血浆中间歇性检测阳性，当HBV DNA可检测到时，其浓度很低，通常低于200 IU/mL[1]。

二、病毒学和免疫学

(一)OBI分子基础与被感染肝细胞核中cccDNA稳定性和长期持久性有关

染色体外的HBV cccDNA以染色病毒微型染色体形式存在，非常稳定且持久，加上肝细胞半衰期很长，这意味着HBV感染一旦开始，即使经过有效的免疫控制，也可能终身感染[2-3]。

(二)宿主免疫和表观遗传机制抑制病毒复制活性和病毒蛋白表达 OBI患者具有低水平转录活性的cccDNA，导致HBV RNA转录水平低或不可测，影响随后的蛋白质翻译和表达[2-4]。但在OBI患者中cccDNA具有完全复制能力[5]。HBsAg自发清除或由于治疗引起HBsAg清除后，HBV感染者的肝细胞中可能存在整合到宿主基因组的HBV DNA[6]。然而， OBI被认为是具有复制能力的HBV DNA的长期存在，而整合的HBV DNA不具有复制能力，因此诊断OBI不需要检测整合的HBV DNA。

(二)OBI的HBV免疫应答 OBI与抗病毒免疫应答有关，这些免疫应答被认为是维持HBV控制的重要因素。OBI在全球高流行表明，免疫系统可控制大多数OBI患者的HBV(即使没有完全清除)。持续/间歇性低浓度HBsAg持续刺激OBI患者的抗病毒免疫应答[7-8]。抗病毒保护机制的效率差异可能与免疫系统暴露于高抗原和高病毒载量的时长有关[9]。一项通过检测HBV DNA证实OBI患者免疫应答的研究显示，OBI血清阳性和OBI血清阴性患者的T细胞对HBV表位的免疫应答不同，尽管体外反应同样微弱，但在血清阳性的OBI患者中，特异性肽刺激后的体外T细胞扩增通常比血清阴性的OBI患者更明显[10]。不仅T细胞，用B细胞选择性单克隆抗体治疗的患者中观察到频繁的HBV再激活，也提示体液免疫反应在OBI宿主调控中也很重要[11]。固有免疫也可能有助于隐匿感染的乙型肝炎病毒的控制，但目前还没有这方面研究。

三、诊断

OBI的诊断基础是检测HBsAg阴性者的血液或肝脏中的HBV DNA。肝内cccDNA检测是金标准。血液中的HBV DNA检测是常用的方法。OBI的诊断基于HBV DNA和HBsAg检测方法的灵敏度。当前大多数HBsAg检测试剂下限为0.05 IU/mL。 最近研究发现，使用这些试剂检测阴性的样本中有1%至48%的样本使用更敏感试剂(检测下限为0.005 IU/mL)检测出现HBsAg阳性[12-13]。除了灵敏度外，目前的HBsAg检测试剂在检测S-逃逸变体的能力上也存在差异[12,14]。建议所有HBsAg的检测都应该使用针对HBsAg多表位的抗-HBs探针，以确保检测到HBV S基因变异。

此外，所有血清学检测均在免疫复合物存在下检测到过量的HBsAg。因此，在HBV感染者中，如果同时出现过量的抗-HBs，可能会干扰HBsAg的检测。在这种情况下，如果能通过某些检测方法，将HBsAg与HBsAg和抗-HBs结合的免疫复合物解离，那么某些OBI患者可能会变成HBsAg阳性[15]。

目前大多数HBV DNA检测试剂的检测下限为10～20 IU/mL。HBV DNA通常以低浓度存在，并且只能在OBI患者中间歇性地检测到，对不少于1 mL血清或血浆的提取物进行检测，以诊断OBI。

诊断OBI的理想方法是检测肝脏中cccDNA。但目前尚无用于检测肝脏cccDNA的标准化有效检测方法。目前推荐的方法包括扩增至少3个不同的病毒基因组区域的巢式PCR、实时荧光定量PCR或液滴数字PCR[2,16-17]。

血液中抗-HBc检测可作为识别血液或器官供者、即将接受免疫抑制治疗的人以及流行病学研究中OBI的替代标记。在这些情况中，通常无法获得肝组织，血液中HBV DNA的检测可能受到限制或延迟，并且在1个时间点检测的血液中检测不到HBV DNA并不排除OBI。 抗-HBc检测可能会发现一些OBI的献血者，他们在微型池核酸检测中有检测到之前无法检测到的HBV DNA[18]。值得注意的是，尽管血清阴性OBI在人群中的流行和临床意义尚不清楚，但是抗-HBc检测阴性并不排除OBI。

四、流行病学

由于OBI的流行病学取决于HBsAg和HBV DNA检测方法的性能和灵敏度，因此要确定OBI的流行病学可能存在一定困难，具体取决于HBV暴露和存在的危险因素、肝病的严重程度、特定国家普通人群中HBV的流行率，以及OBI的定义。目前大多数流行病学研究都是针对献血者和肝病患者进行的。这些人群中OBI的患病率与该地理区域和研究人群中的显性HBV感染率有关。由于检测方法的局限，一般人群中OBI的患病率仍然没有定义。OBI在慢性肝病中的患病率较高，在HBsAg阴性的肝细胞癌(HCC)中可能高达40%～75%[19]。在献血者中很少检测到OBI，HBsAg阴性的血样中HBV DNA检出率通常低于0.5%[20]。HBsAg和HBV DNA检测的特异性和敏感性、研究人群的特征、HBsAg阳性感染在一般人群中的流行情况以及用于定义OBI的标准都可以影响OBI流行率。因此，很难在不同研究之间进行数据比较和荟萃分析。

五、传播

(一)输血 HBsAg阴性、HBV DNA阳性的血液被认为具有传染性。在低收入和中等收入国家，来自OBI献血者的HBV传播仍然是一个主要的健康问题，因为这些国家没有实施抗-HBc和/或核酸检测。即使在发达国家，也存在输血传播OBI的残留风险，因为HBV DNA的最低感染剂量低于当前核酸检测的检测下限。来自OBI供体的输血相关HBV传播的发生率可能被低估了。可能被低估的原因包括：(1)献血者体内无法检测或间歇性检测到HBV DNA；(2)难以追踪或不愿追踪受试者；(3)献血者血样数量不足或有限；(4)没有明显临床表现的急性肝炎受者的HBV感染通常不被注意。

(二)肝移植 HBV可从OBI血清阳性的肝供体传播到HBV易感的受体。这些受体应接受终身预防性核苷类似物(NUC)治疗，以防止HBV感染。即使清除了HBsAg，HBV仍会在感染者的肝脏中持续存在。因此，OBI肝供体可以将HBV感染传播给HBsAg阴性、抗-HBc阴性和抗-HBs阴性的受者，并可能发展为乙型肝炎[21]。建议使用NUC长期预防性抗病毒治疗，例如恩替卡韦或替诺福韦[22]。但是，虽然可以预防HBsAg阳性感染，但抗病毒药物的预防可能无法阻止受体OBI的发生[23]。尽管血清中没有检测到HBsAg和HBV DNA，但肝移植的OBI仍很常见。因此，对于所有因乙型肝炎进行肝移植的患者，建议终生预防性使用NUC[23]。

(三)母婴传播 尽管出生时有主动/被动免疫预防，但HBsAg阳性母亲的新生儿仍可能会发生OBI[24-25]。世界卫生组织提出了2030年消灭乙型肝炎病毒的目标。消除乙型肝炎母婴传播是实现这一目标的重要策略之一。新生儿1岁之后，来自母体被动转移的抗体应该已经消失，这时候如果免疫预防不能完全阻止HBV感染，但成功调节了感染，防止其进展为慢性HBV感染，这时候如果检测抗-HBc阳性、HBsAg阴性，则诊断为新生儿OBI。

六、临床意义

在绝大多数情况下，OBI不会导致任何临床后遗症。然而，OBI可能导致HBV感染血液或器官移植受者，并且在接受癌症化疗或其他免疫抑制治疗患者HBV复制的再激活[26]。

七、抗病毒治疗

当前不建议OBI患者进行抗病毒治疗。基于数字微滴PCR的cccDNA定量检测和更敏感的检测方法的发展，研究表明在NUC治疗期间，病毒抑制的慢性乙型肝炎患者和有OBI的肝脏供体中，有检测到低至1拷贝/105肝细胞的cccDNA的可能性[27]。为了从OBI患者中消除HBV，必须消除感染了HBV的肝细胞或治愈这些细胞。理论上可以研究几种途径：(1)通过cccDNA靶向策略消除肝细胞内cccDNA(如采用CRISPR/Cas9技术等基因编辑方法或细胞因子介导的cccDNA降解)；(2)使用旨在恢复HBV特异性T细胞应答的策略、治疗疫苗接种策略、工程化T细胞疗法来特异性杀死感染的肝细胞或HBV-T细胞受体工程化的T细胞杀死肝脏中残留的感染细胞。

这不仅需要这些尖端技术适应临床应用，还需要对cccDNA生物学和免疫控制以及在OBI环境中感染的肝细胞数量有更多的了解。

2018年OBI研讨会围绕OBI患病率、临床影响和病毒/免疫机制的争议和不确定性，提出了以下待解决的问题：

1. 流行病学和临床研究

(1) 采用标准化的OBI研究报告方法，以便对研究结果的比较和合并；

(2) 开发更灵敏、标准化和有效的用于检测血液和肝脏中HBV DNA的检测方法；

(3) 开发更灵敏、标准化和经过验证的用于检测血液中HBsAg的检测方法，包括检测HBV S变异体和存在抗-HBs免疫复合物中的HBsAg；

(4) 使用标准化的定义和适当的检测方法，确定世界各地，特别是献血者中的OBI患病率；

(5) 确定从OBI血液、器官、组织和细胞供体传播HBV的风险，并根据当地的患病率和可用资源，确定防止此类传播的最佳策略；

(6) 定义OBI的临床意义，尤其是OBI在具有其他可确定的肝病原因的患者以及无可确定的病因(隐源性肝病)的患者中在HCC中的作用，以及在加速(或不加速)发展为肝硬化中的作用；

(7) 协调关于预防OBI患者乙型肝炎病毒再激活的国际建议指南。

2. 基础/转化医学研究

病毒学：确定因HBV变异导致的OBI的普遍性，以及OBI的分子病毒学的决定因素；免疫学：确定OBI的免疫调控与显性HBV感染之间的区别，以及如何利用OBI的免疫调控机制实现HBV功能性治愈，确定干扰OBI的免疫调控导致HBV再激活的原因。

OBI是一种常见性疾病，值得科学界、医学界和公共卫生界的关注。本次研讨会提出的许多关于OBI的问题，希望在10年后的下一次研讨会上能得到令人满意的解决。