额尔齐斯河流域不同来源哲罗鲑形态及COⅠ基因比较研究

郭爱民 喀迪尔丁·艾尔肯 焦 丽 郝翠兰 陈 琳 潘国强 谢志胜张文润 容梦婕 岳 城

(1. 新疆农业大学动物医学学院, 乌鲁木齐 830052; 2. 新疆众力洋渔业科技有限公司, 乌鲁木齐 830052;3. 布尔津县额河特有冷水鱼繁育开发有限公司, 布尔津 836600)

异域物种形成(Allopatric speciation)理论认为,同一物种的种群若发生地理隔离, 就会阻止种群间的基因流, 经过长期的基因突变、自然选择和环境因素的共同作用后, 隔离形成的不同小种群会逐渐适应不同的生态环境, 逐步形成不同的地理宗或生态型(Geographic race), 不同的地理宗或生态型在分别独自进化, 可形成不同的种[1]。

太门哲罗鲑(Hucho taimen)隶属于鲑形目(Salmoniformes)、鲑科(Salmonidae)、哲罗鲑属(Hucho)[2],是大型冷水性淡水凶猛鱼类, 在1998年出版的《中国濒危动物红皮书·鱼类》中被列为中国的濒危物种[3]。哲罗鲑在新疆俗称“大红鱼”, 因著名的喀纳斯湖“湖怪”传说, 而受到世人广泛关注, 成为额尔齐斯河的乃至新疆的生物名片[4]。20世纪60年代,哲罗鲑在额尔齐斯河流域, 包括布尔津河、哈巴河和喀纳斯湖, 以及黑龙江流域的黑龙江、松花江、牡丹江、乌苏里江等广泛分布[5—9]。研究显示在第三纪早、中期额尔齐斯河流域和黑龙江流域通过西伯利亚水系相连, 起源于西伯利亚的鲑科鱼类在各流域间相互交流、扩散, 到中晚期水体萎缩、河湖分隔渐趋明显, 在第三纪末, 西伯利亚水域和黑龙江流域的鱼类区系已产生很大的差别[10]。李思忠[11]认为额尔齐斯河流域和黑龙江流域的鱼类区系组成相似但有一定差异, 1981年将两个流域划为北方区的额尔齐斯河亚区和黑龙江亚区。有学者认为两个流域的哲罗鲑长期存在地理隔离, 缺乏基因交流, 逐渐适应各自的生活环境, 独自演化繁衍,已产生一定的差异[12,13], 董崇智等[5]的形态学研究表明来自额尔齐斯河的哲罗鲑比黑龙江的哲罗鲑侧线鳞、幽门盲囊数稍多。未见应用分子生物学的方法对两地的哲罗鲑进行比较研究。

由于生态环境改变、过度捕捞等人为原因和哲罗鲑个体大、性成熟晚、个体产卵量小等生物学特性, 我国哲罗鲑的群体数量急剧下降, 分布区域迅速缩小[1,6,14]。世界自然保护联盟(IUCN)2011—2012年期间对世界范围内的哲罗鲑进行了濒危等级评估, 中国太门哲罗鲑(H. taimen)的等级为“濒危”, 且新疆和黑龙江的哲罗鲑在过去3代(51年)的下降率分别约为87%和95%[15]。黑龙江流域的哲罗鲑人工繁育已获成功, 额尔齐斯河流域的哲罗鲑由于野生种群数量稀少, 难以捕获, 濒临灭绝。哲罗鲑因神秘的“湖怪”传说使喀纳斯湖闻名于世, 为顺应相关需求和恢复其自然种群, 新疆由黑龙江引进了哲罗鲑进行养殖, 2011年将引进的4万余尾哲罗鲑子一代放流到额尔齐斯河流域[16]。有专家认为额尔齐斯河和黑龙江存在地理隔离, 两地分布的哲罗鲑有差异, 也有专家表示两地的哲罗鲑是同一种,学者们各执己见, 没有充足的理论依据, 故哲罗鲑引种、养殖及放流的合理性、科学性存在的争议。

我们在野外采样工作中得到了数尾哲罗鲑, 为比较两地哲罗鲑的异同, 我们同时采集了当地引进的哲罗鲑, 进行了形态学观察, 扩增COⅠ基因, 进行了基因差异的研究, 以探究额尔齐斯河流域野生哲罗鲑和引进的哲罗鲑的差异, 以期为哲罗鲑的引种放流和土著物种的保护提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 鱼样采集

将额尔齐斯河流域白哈巴河采集到的哲罗鲑标记为HuchoBHB, 将额尔齐斯河流域的布尔津县某水库采集到的哲罗鲑标记为HuchoBEJ, 将布尔津县某冷水鱼养殖公司引进的黑龙江哲罗鲑标记为HuchoHLJ。分别从3个来源的哲罗鲑尾鳍剪切小块组织(约0.3 cm×0.5 cm×1.0 cm)放入1.5 mL Eppendorf管中, 加95%酒精保存。

1.2 形态学观察

由于标本鱼为活体, 主要观察了哲罗鲑的外部形态, 未对幽门盲囊数等内部特征进行解剖观察。

1.3 分子生物学研究

DNA 提取将95%酒精保存的鳍条各剪取约20 mg, 用滤纸擦干酒精后剪碎, 放入1. 5 mL离心管中用Omega软体动物DNA小量提取试剂盒提取DNA。相关操作依据试剂盒说明书进行。

基因扩增及测序PCR扩增采用标准的25 μL体系, 2×EasyTaqPCR SuperMix 12.5 μL, 1 pmol/μL上下游引物各1 μL, 10 ng/μL的模板2 μL, ddH2O 8.5 μL。COⅠ正向引物为TyrCOⅠ： 5′-CTGTTTAT GGAGCTACAATC-3′,COⅠ反向引物为SerCOⅠ：5′-GTGGCAGAGTGGTTATG-3′[17]; 反应程序为：94℃预变性5min; 94℃变性30s, 56℃退火30s, 72℃延伸90s, 30个循环; 最后72℃延伸10min。PCR反应结束后, 将扩增产物经1%琼脂糖电泳分析, 目的条带切胶后用OMEGA公司的胶回收试剂盒进行纯化, 纯化产物连接到pEASY-T1载体上, 并转入感受态大肠杆菌DH5α细胞中, 经蓝白斑筛选后, 选取2个阳性克隆送上海生物工程股份有限公司测序。纯化产物送上海生工生物公司进行测序。

序列比对及系统发育树构建从GenBank中下载所有含有哲罗鲑COⅠ基因的序列共来自10个样本以及一条图们江细鳞鲑序列作为外类群(表1), 用mega 6.0将下载序列与本研究得到的3个序列进行比对, 删除两端无法对齐的碱基, 用最大似然法和邻近法构建系统发育树并计算遗传距离进行分析。

2 结果

2.1 形态学特征

HuchoBHB、HuchoBEJ和HuchoHLJ的形态相似, 体长形, 略侧扁, 呈圆筒形; 头部略扁平, 有许多的黑色圆斑; 口端位, 口裂大; 吻略尖, 上颌较下颌略突出; 上颌骨明显、游离, 其末端延伸到眼后缘之后; 眼侧上位, 眼间距宽; 鼻孔1对, 位于眼前上方, 距眼较距吻端近; 上、下颌骨、犁骨、腭骨和舌上均有向内倾斜的锐齿; 体被椭圆形小鳞,鳞前端较尖而后端较钝; 侧线完全, 位于体中侧;背鳍起点处于体中部稍前, 胸鳍侧下位, 起点稍后于腮盖膜后缘, 腹鳍位于背鳍基后端之下, 胸、腹鳍较小, 腹鳍基部有腋鳞, 臀鳍与脂鳍相对应; 体侧有多数密集如粟粒状的暗黑色小十字形斑点。但HuchoBHB背部为苍青色, 腹部银白色, 斑点小,斑点少而淡, 皮色通透;HuchoBEJ和HuchoHLJ的背部为黑褐色, 斑点大, 斑点黑而密, 皮色不通透(图1)。董崇智等[1]此前对黑龙江流域和额尔齐斯河流域的哲罗鲑进行了详细的形态学测量及解剖学研究(表2)。

2.2 分子生物学结果比较

电泳结果显示COⅠ基因片段大小约为1600 bp,这与预期结果一致; 测序所得序列与从GenBank下载序列进行比对、计算遗传距离并构建系统发育树(图2、图3)。

表1 来自GenBank的哲罗鲑基因序列Tab. 1 Gene sequences of Hucho from GenBank

从基于COⅠ基因的ML树看,HuchoBHB、HuchoBEJ和HuchoHLJ与俄罗斯阿穆尔河(中国称黑龙江)的太门哲罗鲑(H. taimen)聚为一个大的分支, 在这个大的分支下,HuchoBEJ和HuchoHLJ与俄罗斯阿穆尔河(中国称黑龙江)的太门哲罗鲑(H.taimen)聚到一起, 而HuchoBHB形成一个独立的分支。这个大的分支又与我国的川陕哲罗鲑(H.bleekeri)和欧洲的多瑙哲罗鲑(H. hucho)聚成的分支形成一个总的分支。NJ树的结果与ML树结果相一致。

图1 额尔齐斯河流域不同来源哲罗鲑的形态Fig. 1 Morphologes of different sources of Hucho in the Irtysh River basin

从基于COⅠ基因的遗传距离看(表3), 川陕哲罗鲑(H. bleekeri)与太门哲罗鲑(H. taimen)的种间距离为0.0127—0.0160, 川陕哲罗鲑(H. bleekeri)和多瑙河哲罗鲑(H. hucho)的遗传距离为0.0140—0.0166,多瑙河哲罗鲑(H. hucho)与太门哲罗鲑(H. taimen)的遗传距离为0.0134—0.0160, 说明哲罗鲑的属间距离大约在0.0127—0.0160; 已发布的各太门哲罗鲑(H. taimen)相互间的遗传距离为0—0.0038, 说明太门哲罗鲑的种间遗传距离在0.0038左右。HuchoHLJ与俄罗斯阿穆尔河(中国称黑龙江)太门哲罗鲑(H. taimen)的遗传距离为0—0.0031,HuchoBEJ与俄罗斯阿穆尔河太门哲罗鲑(H. taimen)的遗传距离为0.0006—0.0044,HuchoHLJ和HuchoBEJ的遗传距离为0.0038, 与太门哲罗鲑(H. taimen)的种间遗传遗传距离相一致;HuchoBHB与俄罗斯阿穆尔河、太门哲罗鲑(H. taimen)的遗传距离为0.0057—0.0076,HuchoBHB与HuchoHLJ和HuchoBEJ的遗传距离为0.0082和0.0057, 明显大于太门哲罗鲑(H. taimen)的种间遗传距离。HuchoBHB与川陕哲罗鲑(H.bleekeri)和多瑙河哲罗鲑(H. hucho)的遗传距离为0.134—0.160, 与哲罗鲑的属间遗传距离(0.0127—0.0160)相一致, 这些结果说明HuchoHLJ、HuchoBEJ、HuchoBHB均为太门哲罗鲑(H. taimen), 但HuchoBHB与HuchoHLJ和HuchoBEJ及俄罗斯阿穆尔河分布的太门哲罗鲑(H. taimen)遗传距离较大, 在基因上存在一定差异。

表2 不同水域哲罗鲑的主要性状Tab. 2 Main traits of Hucho in different waters

图2 基于哲罗鲑COⅠ基因的系统发育树(ML)Fig. 2 Phylogenetic tree (ML) based on COⅠ gene of Hucho

3 讨论

3.1 形态学特点

形态学观察表明, 3种来源的哲罗鲑形态基本一致, 但存在部分差异：HuchoBHB背部为苍青色,腹部银白色, 斑点小, 斑点淡而少, 皮色通透;HuchoBEJ和HuchoHLJ背部为黑褐色, 斑点大, 斑点黑而密, 皮色不通透, 说明HuchoBHB与HuchoBEJ和HuchoHLJ在形态上有一定差异。本研究由于野生样本为活体, 未对幽门盲囊数进行统计, 但据董崇智等[1]研究, 来自额尔齐斯河流域的哲罗鲑较黑龙江流域的哲罗鲑侧线鳞、幽门盲囊数稍多, 表明2个流域的哲罗鲑在解剖构造上存在一定差异。

查阅各种含有哲罗鲑形态学描述的书籍发现不同专家对哲罗鲑的形态学描述略有不同, 如吻型特点, 石琼等[24]、孙晨旭等[25]、袁国映[26]的描述是“吻尖”, 郑葆珊[27]的描述是“吻钝”, 而中国科学院动物所等机构联合出版的《新疆鱼类志》中的描述则是“吻略尖”[28]; 对于口位的描述, 郑葆珊[27]的描述为“口前位”, 其他书籍中则描述为“口端位”[24—26];鳞片特点, 大多的描述为“鳞极细小, 椭圆形”[25—27],《新疆百科全书》[29]的描述则是“鳞片很小, 呈三角形”, 郑葆珊[28]的描述则为“体背椭圆形小鳞, 鳞前端略尖, 后端较钝”。我们认为, 导致这些形态描述特点不一致的原因可能跟样本的采集地不同、样本采集的时间、形态描述时的用词差异等有关。

图3 基于COⅠ基因的哲罗鲑系统发育树(NJ)Fig. 3 Phylogenetic tree (NJ) based on COⅠ gene of Hucho

表3 基于哲罗鲑COⅠ基因的遗传距离矩阵Tab. 3 Genetic distance matrix based on the COⅠgene of Hucho

3.2 基因序列差异

由系统发育树可看出,HuchoBHB、HuchoBEJ和HuchoHLJ与俄罗斯阿穆尔河(中国称黑龙江)的太门哲罗鲑(H. taimen)聚为一个大的分支, 在这个大的分支下,HuchoBEJ和HuchoHLJ与俄罗斯阿穆尔河的太门哲罗鲑(H. taimen)聚到一起, 而HuchoBHB形成一个独立的分支。由遗传距离矩阵可看出,HuchoBEJ和HuchoHLJ与俄罗斯阿穆尔河太门哲罗鲑(H. taimen)的遗传距离为0—0.0044,与太门哲罗鲑(H. taimen)的种间距离相一致, 说明HuchoBEJ和HuchoHLJ为太门哲罗鲑(H. taimen);HuchoBHB与俄罗斯阿穆尔河的太门哲罗鲑(H.taimen)的遗传距离(0.0057—0.0076)约为太门哲罗鲑(H. taimen)种间距离(0—0.0038)的两倍, 与川陕哲罗鲑(H. bleekeri)和多瑙河哲罗鲑(H. hucho)的遗传距离(0.0134—0.0160)与哲罗鲑的属间遗传距离(0.0127— 0.0160)相一致, 说明HuchoBHB为太门哲罗鲑(H. taimen), 但与俄罗斯阿穆尔河的太门哲罗鲑(H. taimen)在基因上的存在较大差异。

3.3 三个不同来源哲罗鲑的关系

相关研究表明冷水鱼对冷水产卵环境具有独特的选择性, 和冷水鱼强烈的返家繁殖习性及很弱的扩散能力, 地理种群间很容易因基因交流出现障碍而产生显著的遗传分化[30—33]。马波等[34]的研究表明, 尽管水系相连, 但在嫩江上游、黑龙江、图们江中的细鳞鲑表现出形态差异, 推测其为地理隔离导致的遗传分化, 认为图们江的细鳞鲑是尖吻细鳞鲑的一种特殊的地理生态类群。

我们的研究结果在形态学表征和分子数据皆显示, 额尔齐斯河流域和黑龙江流域的哲罗鲑由于长期的地理隔离, 适应不同的地理环境, 进化繁衍, 从而在形态和基因上都产生了较大差异, 特别是基因序列方面, 来自额尔齐斯河流域的HuchoBHB与黑龙江流域的哲罗鲑在进化树上形成单独的分支, 遗传距离为黑龙江流域哲罗鲑种间距离的两倍, 可作为太门哲罗鲑(H. taimen)的不同生态地理类群。而HuchoBEJ与HuchoHLJ及俄罗斯阿穆尔河的哲罗鲑(中国称黑龙江)在进化树上聚到了一起, 遗传距离为0—0.0044, 与太门哲罗鲑中间距离相一致, 我们推测HuchoBEJ为当年放流或养殖场逃逸的哲罗鲑。

3.4 关于引种问题的探讨

外来种(Alien or exotic species)是指那些出现