五大连池药泉湖沉积物的细菌多样性

杨孟然，邢维佳，赵丹，王伟东，王彦杰，晏磊

（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319）

在世界各个生境之中，湖泊是各生境中重要的存在，不同湖泊的沉积物之中含有大量的微生物，微生物是湖泊中重要的生态资源，参与多种物质循环[1]。因此，深刻解析湖泊沉积物中的微生物群落组成和多样性的变化。对正确认识湖泊沉积物和它参与的物质交换与营养循环具有重要意义。细菌多样性也能在一定程度上反应出细菌所处环境的变化。

沉积物中的细菌多样性一直是不同的水体科学研究热点。丰富的营养物质与特殊环境会使得沉积物成为水体细菌的理想栖息地。细菌在以铁、硫为主要元素的地球化学循环中有着重要作用[2]。五大连池的药泉湖是一个矿泉湖，其水质与其他湖泊不同，是比较少有的湖泊水体类型。此外，药泉湖内的泉水可以引流到不同地域，为人所用。药泉湖气候多变，环境条件较差，但是也正是这种气候成就了药泉湖的特殊环境。药泉湖中含有大量的沉积物，寒冷的冬季寒冷风不停。药泉湖地处高纬度的地区，它的气候又受到来自大兴安岭等地寒温带的气候与松嫩平原等地半干燥的气候影响。药泉湖常年的平均温度－0.4 ℃，气温最低的时间在一月份左右。平常年平均的降雨量是476.3 mm 左右，大多数集中于6 到8 月。在一年最寒冷的时候，药泉湖地面的冻土深度可达2.47 m。因此，为了探究特殊环境下的细菌多样性，我们选择药泉湖作为研究地点[3]。

以五大连池药泉湖的沉积物混合的样品中的细菌为研究目标，通过Hiseq 高通量测序技术来分析五大连池火山群内药泉湖沉积物细菌的系统发育多样性并结合相应沉积物混合样品的代谢途径，推测其功能应用。观察在药泉湖这种特殊环境下细菌的多样性。

1 材料与方法

1.1 采样材料

采集位于五大连池药泉湖表层沉积物样品（湖泊沉积物界面以下5 cm 左右）。采用柱状采泥器在药泉湖的3 个不同位置分别采集样品。样品采集完成，装入灭菌的样品瓶内，低温避光带回研究。

1.1 实验方法

1.2.1 沉积物细菌总DNA 的提取与纯化

利用Biomed DNA 的提取试剂盒对药泉湖沉积物样品进行DNA 提取，并使用Axygen 的纯化试剂盒对DNA 进行纯化。

1.2.2 细菌16S rDNA 的PCR 扩增

采用细菌16S rDNA 的通用的引物27F 和1492R，反应体系50 μL。PCR 产物利用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。反应条件：94 ℃变性5 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min 30 个循环。

1.2.3 总DNA 质量检测

DNA 纯度和浓度的测定：使用Nanodorp2000 测定所提取DNA 溶液的260 nm 与280 nm 比值，如果260 nm 与280 nm 比值在1.8 到2.0 之间说明DNA完整，同时可测出DNA 浓度。可以利用琼脂糖凝胶电泳观察DNA 条带的亮度去判断DNA 降解的情况和蛋白质及其他杂质的污染状况。

1.2.4 物种注释及分类学分析方法

（1）物种注释：置信度的阈值是0.8。

（2）序列系统分析：利用PyNAST 软件中的Neighbor-Joining 构建系统进化树[4]。

1.2.5 Alpha 多样性分析平台利用Alpha 多样性分析手段来分析样品内微生物群落多样性的分析方法，通过Alpha 多样性分析就可以充分了解药泉湖样品的微生物群落丰富度和多样性，利用统计学与稀释曲线分析指数进行评估。

设定相似性为97%的序列聚类成OUT，97%稀释性曲线用来说明药泉湖样品的测序数据量合理性，并反映细菌的物种的丰富度。曲线渐渐趋向平缓，可以证明测序数量合理，等级丰度曲线可解释样品所含物种的丰富度与均匀度[5]。

1.2.6 Beta 多样性分析

利用Beta 多样性分析手段沿环境梯度分析药泉湖样品群落之间物种组成的差异性。利用Qiime 平台和Mothur 平台等平台软件对样品进行分析[6]。

2 结果与分析

2.1 沉积物中细菌Alpha 多样性

普遍的Alpha 多样性指数分析主要有Chao1、Shannon、Observed Species、Simpson 等。通过Alpha 多样性分析可以反映药泉湖样品内的细菌群落的多样性和丰富度。药泉湖样品Shannon 指数为6.21，Chao1 指数为1 369，药泉湖样品中细菌群落多样性较高，它的群落物种的丰富度也处于较高水平[7]。通过稀释曲线图可以看到样品中细菌16S rDNA V3+V4 区基因上达到平和，这足以说明药泉湖各个样品中全部序列完全获得火山堰塞湖表层沉积物样品中的细菌，说明实验测序量的合理性。

2.2 沉积物中细菌群落组成分析

细菌16SrDNA V3+V4 区测序结果显示，药泉湖表层沉积物主要菌门为变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、绿菌门（Chlorobi）、消化螺旋菌门（Nitrospirae）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、浮霉菌门（Planctomycetes）等。其中，在药泉湖中占据优势的菌门为变形菌门（38.21%）和放线菌门（27.36%），其中丰度大于1%的菌门有拟杆菌门（12.82%），芽单胞菌门（4.16%），疣微菌门（3.10%）和绿菌门（2.24%）。在属的水平上，统计了大于1%丰度的菌属，药泉湖内优势菌属为鞘氨醇单胞菌属，嗜甲基菌属，芽单胞菌属，慢生根瘤菌属。其中，鞘脂杆菌属为T01 独有的属。从上述数据分析可知药泉湖内的细菌物种丰度较丰富，湖内含有细菌多样性也较为丰富（图1）。T01、T02、T03、T04 分别是药泉湖的四个采样点。

图1 门水平样品物种分布图Fig.1 Species distribution in phylum level

图2 属水平样品物种分布图Fig.2 Species distribution in genus level

2.3 稀释性曲线

稀释性曲线，从药泉湖沉积物样品中随机选取一些序列，统计这些序列所代表的物种数。随后利用序列数与物种数构建曲线，验证了药泉湖样品中物种多样性的可靠，并且反映了药泉湖沉积物样品中物种的丰富度[8]。图2 反映了持续抽样时新OTU 出现的速度比率：在一定的范围内，随着测序条数的不断增加，药泉湖样品的曲线首先表现为急速上升，证明了样品细菌群落中发现有大量物种。之后图中的曲线逐渐趋于平缓，表示药泉湖中的物种并不会随测序数量的增加而显著增多。该图足以证明药泉湖沉积物样品序列数量达到反应物种多样性及丰富程度的要求，该图也可以看出在不同位点物种丰富度都较高。

图3 样品稀释曲线图Fig.3 Dilution curve

2.4 功能分析

通过KEGG 代谢途径的差异分析，观测药泉湖沉积物不同分组的样品之间的微生物群落的功能基因在代谢途径上的变化和差异，可以充分反映药泉湖沉积物中群落样本为适应环境变化而发生的代谢功能改变。由图4 可以明显发现四个采样位点的基本代谢途径十分相似，在氨基酸代谢，碳水化合物代谢，细胞群落代谢这三个代谢途径中药泉湖沉积物样品丰度是最高的，可见在这三个代谢途径中，细菌种类繁多，数量较大，是对于药泉湖十分重要的代谢途径，也是主要的途径，本文还对四个采样位点进行两两比对，发现，尽管细菌丰度较高的三个代谢途径在四个位点都是一致的，但是不同位点间有部分代谢途径还存在着差异，例如在细胞生长与死亡、循环系统、消化系统、内分泌系统等代谢途径在几个位点的对比之中都存在或多或少的差异（图5）。尽管四个位点是从同一个湖泊采集，但是湖泊中的不同位置的沉积物样品之间的差异也可以说明，同一个湖泊的主要代谢途径是固定的，其中的细菌丰度与多样性差异不会很大，但是同一湖泊的不同位置，次要的代谢途径有可能会出现差异，细菌丰度及多样性也会有一定差异。

图4 KEGG 代谢途径差异分析柱状图Fig.4 Histogram analysis of KEGG metabolic pathways

图5 组间KEGG 代谢途径差异分析图Fig.5 Comparison of KEGG metabolic pathways between groups

3 结论与讨论

实验选取了五大连池药泉湖四个沉积物采样点的样品进行测序分析，在药泉湖中，广泛存在的优势细菌类型包括变形菌和放线菌类群，他们在药泉湖各个位点上均占有较大的比例。变形菌类群的优势也体现在众多不同的环境中。苏洁等[9]在南沙海区的深海沉积物中对细菌多样性的研究分析中也同样发现变形菌的优势，同时指出细菌多样性的丰富程度与环境的不同有较大关联；李会荣等[10]在北极太平洋扇区的海洋沉积物之中研究细菌多样性的系统发育，也同样发现了高丰度的变形菌的身影；侯梅锋等[11]在连云港海底的底泥细菌多样性系统分析中发现变形菌丰度高达49.2%。除了在海洋环境中，在湖泊中变形菌的优势也十分明显，例如人们发现在新疆两湖和湖南岳阳洞庭湖等湖泊环境中变形菌的丰度也相较占优势[12]。可以发现，无论是在海洋底泥中，还是淡水湖泊沉积物中，以及提及的火山堰塞湖沉积物这种特殊环境下的湖泊中，变形菌群的优势是十分明显的。

沉积物中各种类型的变形细菌是海洋和湖泊沉积物中微生物群落中重要的组成部分[13]。国内外许多研究已经表明变形细菌在太平洋深海沉积物的生物地球化学过程[14]中起着重要的作用，比如多种类型的γ 变形细菌在硫元素循环中同时还参与氧化和还原两种作用[15]。研究表明，湖泊水体细菌在参与的生物地球化学过程中都起到重要的作用。与多数生境一样，湖泊中的细菌在以C、S 等元素为主的生物地球化学循环过程中作用不可忽视[16]。除了变形菌之外，其他药泉湖沉积物中的菌群也有着十分重要的作用，例如绿菌门被发现在厌氧环境中存在许多还尚不可知的作用[17]，放线菌门是一种具有巨大开发价值的资源，是微生物天然产物中最重要的产生菌之一[18]，硝化螺旋菌门是湖泊中参与氮循环的主要作用者[19]。药泉湖沉积物中各个菌群均参与生物地球化学循环过程，由于是沉积物样品，沉积物处于厌氧环境，所以特别有利于反硝化细菌的生存，其大部分存在于沉积物中，尤其是在深水湖泊的底层或者局部厌氧的环境中，能充分发挥反硝化作用，硝化、反硝化的联合产氮的作用也一直是被认为湖泊氮损失的主要途径[20]。

药泉湖沉积物中含有丰富的细菌菌群，丰度占具优势的菌群与大多是深水、湖泊、海洋沉积物细菌多样性的研究结果相同或类似。药泉湖沉积物中的细菌多样性丰富且不同位点的沉积物样品细菌多样性及丰度有一定的差异，差异的原因有可能由于药泉湖是半封闭型水体，湖泊内水流大小以及水流速度不及开放型水体，多个采样位点存在差异，也说明药泉湖整体湖泊细菌多样性丰富。目前多项研究均表明湖泊水体细菌群落的多样性与物种分布的特征环境决定与随机分布两种过程共同作用的结果。目前对湖泊细菌功能的研究，也主要集中于多数细菌参与下的湖泊水体生产力与元素的生物地球化学循环过程，参与循环过程中的许多具体功能，还有待研究，目前，人们对于湖泊细菌群落多样性和功能的认识与了解还十分有限，对于特殊环境的湖泊细菌多样性的研究更是匮乏，因此对火山堰塞湖的研究，希望可以为后续的研究提供理论支持。