基于响应面法的山楂果核总黄酮闪式提取工艺

杨燕新，邱相坡，于欢，王文斌*

(1.山西农业大学 文理学院，山西 太谷 030801；2.山西农业大学 生命科学学院，山西 太谷 030801)

山楂(CrataeguspinnatifidaBunge)为蔷薇科植物，又名山里红，在亚洲、欧洲、北美洲以及南美洲均有分布，在我国北方分布较广[1]。山楂可药食两用，具有消积化滞、补脾健胃、行气散瘀和抗氧化的功能，在临床医学上还可用以治疗高血脂、高血压、冠心病以及清除自由基、增强免疫力和抑制肿瘤等[2, 3]。

黄酮类化合物在植物中广泛存在，属于植物的次级代谢产物，并具有很高的药用价值，在心脑血管疾病方面具有较好的疗效，通过其特有的抗氧化作用，从而可以阻止细胞的退化、衰老，甚至癌症的发生[4～6]。山楂主要含有黄酮类、有机酸、三萜类、维生素C等化学成分。有研究表明，山楂的部分药用功能与其所含的黄酮类化合物密切相关[7, 8]。当前社会随着生活节奏的加快和工作压力的日益剧增，高血压、高血脂等疾病的发病率明显增加，并受到人们的普遍高度重视。为此，以黄酮类化合物为基础研究出针对相关疾病的预防药物已受到广泛关注[9]。

我国山楂资源充足，据统计，1995年至2017年我国山楂种植面积由原来500余万亩增加到700余万亩，占我国果树种植总面积的10%左右，产量更是高达300万t[5]。然而，山楂食用后以及工厂药用山楂加工后残余的果核利用率极低，提升山楂果核资源的利用价值具有重要的意义。前人已有研究通过索氏提取、CO2超临界流体萃取法等对山楂果核总黄酮提取工艺进行优化[10, 11]，但未见应用闪式提取的相关报道。闪式提取是近些年发展起来的一种新的提取方法，利用机械剪切刀对材料进行高速切割，并产生强大的真空负压，使化学成分快速溶解于提取液。闪式提取器结合了粉碎、萃取、搅拌、振动、浸渍等技术于一身，不需要加热，能够避免有效成分破坏，且溶剂用量小，效率高，处理量大，使用安全可靠[12]。闪式提取适用范围广泛，可用于植物根、叶、花、果实等多个部位，在银杏叶、野菊花、罗汉松、金锦香等多种植物总黄酮提取方面均有相关的研究报道[13～16]。本文旨在利用响应面分析法对山楂果核总黄酮的闪式提取工艺进行优化，为合理开发利用山楂果核资源及黄酮类化合物的工业化提取提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

山楂鲜果购于山西省晋中市榆次区农贸市场，用刀片取出山楂果核，洗净平铺于滤纸上，放置于60 ℃干燥箱中烘干至恒重后用中药粉碎机进行粉碎，过80目筛，制得山楂果核粉末并储存于干燥的蓝盖瓶中，在4 ℃冰箱密封保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线制作方法

精确称取20.00 mg芦丁标准品于少量无水乙醇中溶解，然后将其完全转移到100 mL的容量瓶中，用60%的乙醇稀释定容，得到0.2 g·L-1的芦丁标准溶液。分别取芦丁标准溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL依次置于6个25 mL的容量瓶中，各加入0.3 mL 5% NaNO2溶液，摇匀后静置6 min；再各加0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液摇匀后静置6 min；最后，分别加入4 mL 4%的NaOH溶液，用60%乙醇溶液稀释定容，摇匀后静置15 min，分别测量在波长510 nm处的吸光度A[13, 17]。并根据不同浓度下测定的吸光度值生成芦丁标准曲线(图1)。

1.2.2 总黄酮的提取

将山楂果核粉末精确称量2.00 g于蓝盖瓶中，电压为100 V，在不同的料液比、乙醇浓度、提取时间条件下进行闪式提取，提取完后的液体完全转移至离心杯中，然后5 000 r·min-1离心15 min，取上清液作为山楂果核试液。

1.2.3 总黄酮含量的测定

本试验采用硝酸铝显色法测定山楂果核总黄酮的含量[13, 17]。取山楂果核试液2.0 mL于25 mL容量瓶中，其余步骤同1.2.1，依次加入0.3 mL 5% NaNO2、0.3 mL 10% Al(NO3)3及4 mL 4% 的NaOH溶液，振荡摇匀，用60%乙醇溶液定容后静置15 min，测量该溶液在波长510 nm处的吸光度A。依据标准曲线计算山楂果核总黄酮的含量，利用以下公式求出其提取率E/%。

E为总提取率/%；C为提取液中黄酮浓度/(g·mL-1)；V为体积/mL；n为稀释倍数；m为称取的山楂果核粉末的质量/g。

1.3 单因素试验

1.3.1 料液比试验

用电子天平分别精确称量山楂果核粉末，按料液比为1∶5，1∶15，1∶25，1∶35 (g·mL-1)比例加入60%乙醇，设置电压100 V，时间90 s完成闪式提取。然后将所得液体于5 000 r·min-1条件下离心15 min，并将上清液转移至4个干净的蓝盖瓶中，分别取不同料液比上清液2.0 mL，同1.2.3完成总黄酮含量的测定并计算不同料液比条件下的山楂果核总黄酮提取率。

1.3.2 乙醇浓度试验

料液比和闪式提取时间分别设置为1∶25(g·mL-1)和90 s，乙醇浓度设置梯度为40%、50%、60%和70%，其余步骤同1.3.1。

1.3.3 闪式提取时间试验

料液比和乙醇浓度分别设置为1∶25(g·mL-1)和50%，闪式提取时间梯度设置为70、80、90、100 s，其余步骤同1.3.1。

1.4 响应面试验设计

以单因素试验结果为依据，通过Design-Expert软件中的Box-Behnken Design程序，分别用A、B、C表示乙醇浓度、提取时间、料液比，每个因素设置低、中、高3个水平，用-1、0、+1表示，设计结果见表1。

表1 试验因素水平设计Table 1 Design of of experimental factors and levels

1.5 统计分析方法

所有试验至少重复3次，采用Microsoft Excel及SPSS 17.0进行标准差计算及显著性差异分析。单因素实验中总黄酮提取率结果用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

图1显示芦丁标准曲线的回归方程为y=8.731 3x-0.008 9(R2=0.999 4)。其中自变量x代表芦丁浓度/(g·L-1)，因变量y为吸光度A。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 单因素试验结果分析

2.2.1 料液比对山楂果核总黄酮提取率的影响

在闪式提取电压100 V条件下，设置乙醇浓度60%，提取时间90 s，得到山楂果核总黄酮的提取率与料液比关系曲线图。由图2可知，在液料比为1∶5～1∶25(g·mL-1)范围内，闪式提取山楂果核总黄酮的提取率呈现升高趋势，在1∶25～1∶35(g·mL-1)之间提取率下降，并且在料液比为1∶25(g·mL-1)时，山楂果核总黄酮的提取率最大。因此，初步选取1∶25(g·mL-1)为最适料液比。

图2 料液比与总黄酮提取率关系Fig.2 Relation between ratio of material to liquid and flavonoids extraction rate

2.2.2 乙醇浓度对山楂果核总黄酮提取率的影响

设置闪式提取电压100 V，选取2.2.1中最适料液比1∶25(g·mL-1)，提取时间90 s，然后得到山楂果核总黄酮的提取率与乙醇浓度关系的曲线图。由图3可知，在乙醇浓度为40%～70%之间，山楂果核总黄酮提取率呈现先升高后降低趋势，并且在乙醇浓度为50%时，山楂果核总黄酮的提取率最大。因此，初步选取50%为最适乙醇浓度。

图3 乙醇浓度与总黄酮提取率关系Fig.3 Relation between ethanol concentration and flavonoids extraction rate

2.2.3 闪式提取时间对山楂果核总黄酮提取率的影响

设置闪式提取电压100 V、料液比1∶25(g·mL-1)、乙醇浓度50%，完成闪式提取，得到山楂果核总黄酮的提取率与闪式提取时间关系曲线图(图4)。在时间70～100 s范围内，提取率随提取时间的延长呈先升高后降低变化趋势，并且在提取时间90 s条件下总黄酮提取率最大。因此，初步选取90 s为最适闪式提取时间。

图4 提取时间与黄酮提取率关系Fig.4 Relation between extraction time and flavonoids extraction rate

2.3 响应面结果分析

依据响应面设计完成不同因素及水平组合条件下的山楂果核总黄酮闪式提取及含量测定。通过Design Expert 8.0.5对表2所得数据进行回归分析，山楂果核总黄酮提取率用响应值Y来表示，二次回归方程模型为下式：

Y=0.64-0.013×A+2.000E-0.003×B+0.020×C-0.012×A×B+7.250E-0.03×B×C+4.250E-0.03×A×C-0.053×A2-0.024×B2-0.024×C2

表2 响应面试验设计及测定结果

由表3可知失拟项不显著，说明该模型拟合良好；均方差P=0.02<0.05，说明此回归模型显著。CV=2.85%，说明此响应面试验精确度良好；信噪比8.368>3，表明此模型对山楂果核黄酮提取率的分析和预测结果准确；R2=0.930 2表明模型拟合程度较高。对回归模型进行显著性分析，得到模型的一次项C显著(P<0.05)，A、B不显著(P>0.05)，二次项A2极显著(P<0.01)，B2、C2显著(P<0.05)，其余项均不显著。各因素对山楂果核总黄酮提取率的影响大小：料液比>乙醇浓度>提取时间。

2.4 多因素间交互作用分析

2.4.1 乙醇浓度和提取时间的交互作用

图5显示在料液比为1∶25时乙醇浓度和闪式提取时间对山楂果核总黄酮提取率的交互作用的3D模型。由图5可见，固定A或者B的任一值，提取率曲线都会随着其中单个因素的增大而先升高后降低，并且提取时间坡度较为平缓，而乙醇浓度的坡度较陡，A与B交互作用较为显著。

图5 乙醇浓度与提取时间对提取率交互影响的响应面Fig.5 The response surface of interaction effect between the ethanol concentration and the extraction time

2.4.2 乙醇浓度和料液比的交互作用

在闪式提取时间90 s时，乙醇浓度与料液比对山楂果核总黄酮提取率的交互作用的3D模型如图6所示。固定A或C中的任一值，提取率的曲线都是随着其中一个因素的增大而先升高后降低，且乙醇浓度的坡度较陡，料液比坡度较为平坦，A与C交互作用较为显著。

图6 乙醇浓度与料液比对提取率交互影响的响应面Fig.6 The response surface of interaction effect between the ethanol concentration and the ratio of material to liquid

2.4.3 提取时间和料液比的交互作用

图7表示当乙醇浓度为50%时闪式提取时间及料液比对山楂果核总黄酮提取率的交互作用的3D模型。由图7可见，固定B或者C的任一值，提取率曲线都是随着其中一个因素的增大而先升高后降低，但是B与C在各自范围内的曲面均较为平坦，因此，B与C交互作用不显著。

图7 提取时间与料液比对提取率交互影响的响应面Fig.7 The response surface of interaction effect between the extraction time and the ratio of material to liquid

表3 回归模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for regression equation

2.5 验证试验

通过分析回归拟合方程和回归模型，依据响应面分析法对山楂果核总黄酮提取率选择maximize模式进行优化，进而得到山楂果核总黄酮最优的闪式提取工艺参数为：料液比1∶29.36(g·mL-1)、乙醇浓度为48.78%、闪式提取时间为91.41 s，山楂果核总黄酮提取率的理论值为0.648%。根据实际操作情况，设置料液比、乙醇浓度、闪式提取时间依次为1∶29(g·mL-1)、49%、91 s进行验证，最终得到山楂果核总黄酮提取率为0.644%。此结果与响应面的理论预测值基本一致，说明采用响应面法优化设计的回归方程能够较好地显示出其各个因素对总黄酮提取率的影响。

3 讨论

前人对山楂果核总黄酮已通过索氏提取、CO2超临界萃取、超声提取等方法进行相关研究[10, 11, 18]，但未见利用闪式提取法的相关报道。本试验基于响应面法对山楂果核总黄酮的闪式提取工艺进行优化，提取参数料液比、乙醇浓度、闪式提取时间依次为1∶29(g·mL-1)、49%、91 s。而通过索氏提取法提取山楂果核总黄酮需长时间回流至无色[10]，CO2超临界萃取需50 ℃、20 MPa、2 h的提取条件[11]，超声波提取参数为60 ℃、50%乙醇、也需40 min超声破碎[18]。相对而言，闪式提取在室温下即可进行，提取时间更短，乙醇用量较少，提取能耗及提取成本更低，通过闪式提取法的山楂果核总黄酮提取率也优于索氏提取法(0.51%)，本试验结果具有更好的实际应用价值。但与CO2超临界萃取及超声提取相比，闪式提取的提取率仍较低，推测可能与山楂来源有关，溶剂及提取参数也有待进一步优化。当前山楂利用的现状是山楂食用后以及工厂药用山楂加工后残余的果核弃之不用，从而造成资源浪费。而近年来植物总黄酮成分的提取利用受到广泛关注，已有研究表明，山楂果肉、果核及叶片总黄酮含量依次降低[10]。因此，本试验结果将对山楂废弃果核总黄酮的资源利用具有重要的参考价值。

4 结论

本研究对山楂果核中的总黄酮进行了闪式提取，并通过单因素试验和响应面分析法对各提取参数进行了优化。试验结果表明，各单因素对山楂果核总黄酮的提取率的影响大小为料液比>乙醇浓度>闪式提取时间，所得最优提取工艺参数分别是料液比1∶29(g·mL-1)、乙醇浓度为49%、闪式提取时间为91 s，山楂果核总黄酮提取率为0.644%。本试验结果将为山楂果核资源的开发利用提供重要的理论参考。