软骨细胞去分化的分子机制的研究进展

林阳洋

(中国医学科学院整形外科医院整形七科，北京市 100000，电子邮箱：183139934@qq.com)

【提要】 软骨组织工程的发展为整形外科耳再造、鼻整形及骨科关节软骨修复等提供了新的思路。但是体外培养软骨细胞出现去分化现象极大地限制了该技术的进一步发展。多种机制参与软骨细胞去分化过程，包括表观遗传学及相关基因通路等。本文就软骨细胞去分化及其相关分子机制的研究进展进行综述。

耳整形、鼻整形及关节软骨修复中的软骨来源一直是再生医学研究领域中的难题，软骨组织工程的发展为解决这一难题提供了新思路，使软骨组织的替代修复成为可能。然而，软骨细胞传代培养中的去分化现象是限制这一技术发展的瓶颈。深入了解软骨细胞去分化的机制，寻找干预细胞去分化的基因靶点，促进去分化软骨细胞再分化，是软骨组织工程的研究热点和难点。本文就软骨细胞去分化及其相关分子机制的研究进展进行综述。

1 软骨细胞去分化程度的标志物

体外培养软骨细胞存在去分化现象，即随着传代次数及培养时间的增加，软骨细胞失去原有表型，由多角形或圆形向成纤维细胞样梭形转变，细胞基因表达谱也发生变化，如Ⅱ型胶原(collagen type Ⅱ，ColⅡ)、软骨特异性蛋白多糖核心蛋白和Y染色体性别决定结构域转录因子(Sox-9)基因表达下降，Ⅰ型胶原(collagen type Ⅰ，ColⅠ)基因表达增加[1]。因此，既往把这些分子作为软骨细胞去分化程度的标志物。

近年来陆续发现一些新的分子指标也可以描述软骨细胞去分化状态。其中，Shin等[2]认为每个传代细胞的运动距离可以作为去分化程度的判断指标。Runx3基因单个CpG位点的甲基化用于体外鉴定软骨细胞的去分化阶段，可更好地描述软骨细胞培养的阶段[3]。表面抗原CD63和CD166可以用于描述再分化过程[4]。S100A1和S100B蛋白属于高酸性钙结合蛋白S100蛋白家族成员，与软骨细胞表型有关，是软骨形成能力的标志物[5]。应用基于细胞的酶联免疫吸附测定法检测上述S100A1和S100B蛋白可准确地判断软骨细胞的分化状态，识别软骨源性刺激，并可同时监测不良肥大表型[6]。上述研究结果丰富了软骨细胞去分化程度的标志物的类型。

2 软骨细胞去分化的表观遗传学

2.1 甲基化与软骨细胞去分化的关系 近年来，DNA甲基化与软骨细胞去分化的关系引起了广泛关注。研究DNA甲基化的第一步是评估甲基化水平。亚硫酸氢盐基因组测序是目前应用最广泛的DNA甲基化分析技术，但是亚硫酸氢盐的转化会导致DNA降解，相关实验必须消耗大量的软骨细胞样品。Jia等[7]采用斑点杂交法测定不同传代次数的软骨细胞5-甲基胞嘧啶的含量，确定了去分化状态与5-甲基胞嘧啶水平之间的关系。虽然该方法不能精确定量DNA甲基化水平或确定特定DNA序列的CpG甲基化状态，但也是一种可靠、简单、快速检测DNA甲基化水平的方法，可以避免大量消耗软骨细胞样本。

软骨细胞单层培养容易发生去分化改变，细胞的甲基化水平也相应地发生不同程度的变化。用DNA甲基化抑制剂5-氮杂胞苷(5-aza cytidine,5-AzaC)处理，可降低总体甲基化水平，减慢软骨细胞去分化，有助于维持细胞表型，因此，调节甲基化水平可能是一种对抗软骨细胞去分化的有效策略[8]。通路富集分析结果显示，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)通路参与了单层培养诱导的软骨细胞去分化；PI3K分别通过Akt和p70S6激酶的下游信号诱导细胞存活和蛋白合成，采用5-AzaC处理可降低PI3K-Akt信号通路相关基因的总体DNA甲基化水平[8]。此外，细胞松弛素D可破坏肌动蛋白细胞骨架，激活PI3K/Akt和p38激酶，从而逆转小檗碱诱导的软骨细胞去分化[9]。改善软骨细胞在传代培养中的形态(主要是细胞骨架的变化)与维持软骨细胞表型密切相关[10-11]。此外，在5-AzaC处理后Sox-9表达上调，ColⅡa1基因的甲基化水平和表达水平没有变化，而ColⅠa1的甲基化水平升高，ColⅠa1启动子活性和mRNA表达水平持续下降，提示Sox-9的DNA甲基化可能是调节Sox-9表达水平的关键因素，提高ColⅠa1启动子的甲基化水平可能可以减缓软骨细胞的去分化，因此，位点特异性启动子甲基化或去甲基化必须得到优化[8]。上述研究提示甲基化、PI3K/Akt信号通路在细胞骨架变化和软骨细胞去分化过程中相互影响，共同促进软骨细胞去分化改变，但甲基化与细胞骨架变化之间的关系，仍有待进一步研究探讨。

2.2 微小RNA与软骨细胞去分化的关系 软骨细胞去分化时，微小RNA(microRNA，miRNA)在调节基因表达上起着重要作用，其中miRNA-138高度保守，可参与细胞凋亡、脂肪细胞分化和成骨过程。研究显示，miRNA-138在完整软骨中维持相对较低的表达水平，但在软骨细胞传代培养过程中，随着细胞表型差异的逐步消失，miRNA-138成为表达水平上调最明显的miRNA之一； miRNA-138可直接靶向作用于Sp-1和缺氧诱导因子2a，抑制ColⅡa1的转录表达，其中Sp-1可与ColⅡa1启动子区域结合以促进ColⅡa1的表达，缺氧诱导因子2a可与软骨主要调节基因Sox-9的启动子/增强子元件结合，是介导软骨细胞特异性基因低氧诱导表达的主要转录因子；此外，miRNA-138在调节软骨细胞表型中具有关键的去分化作用，抑制miRNA-138表达有利于维持软骨稳态[12]。miRNA-138还间接影响miRNA-140和miRNA-675-5′表达水平，从而影响软骨细胞的表型变化。miRNA-675-5′可调控ColⅡa1的表达，而miRNA-140可通过抑制ADAMTS-5(一种聚蛋白多糖酶)的表达来维持软骨内环境的稳定。由于这两种miRNA的表达都依赖于Sox-9，所以这两种miRNA很可能是由miRNA-138通过靶向缺氧诱导因子2a来调节的，而缺氧诱导因子2a反过来与Sox-9结合并促进其转录[13]。此外，有研究显示miRNA-29b在去分化软骨细胞中呈过表达，可选择性靶向抑制ColⅡa1，导致与异常软骨细胞表型相关的胶原失衡[14]。因此，miRNA和转录因子之间复杂的相互作用是调节组织特异性基因表达的核心。表观遗传图谱和生物信息学分析可能是识别区域特异性DNA甲基化的有力策略，而这对维持软骨细胞表型至关重要。

3 参与软骨去分化的基因和通路

3.1 转化生长因子β家族 软骨细胞活动受转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β家族的调节，家族成员包括TGF-β、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)等。

3.1.1 TGF-β：TGF-β是软骨细胞分子和生理特征的主要调节因素，有3种亚型，其中TGF-β1在软骨细胞中的研究最为广泛。TGF-β1信号通路中，两个Ⅰ型受体[激活素受体激酶(activin receptor-like kinase，ALK)]和两个Ⅱ型受体(TβR-Ⅱ)组成四聚体复合物，当二聚TGF-β分子结合到这个四聚体复合物时，ALK被TβR-Ⅱ磷酸化，可进一步诱导Smad2/3的磷酸化[15]。通过慢病毒转染诱导去分化软骨细胞Klf4的表达，可以激活ALK和TβR-Ⅱ，促进马软骨细胞的增殖和成软骨分化[6]。

TGF-β1可促进细胞增殖和细胞外基质合成，抑制金属蛋白酶的活性，有助于维持软骨细胞的特征[16]。TGF-β1可通过β-连环蛋白通路促进软骨细胞增殖，并通过激活Sox9、Smad3及Smad2和Smad4的复合物来促进ColⅡ合成，保持软骨细胞表型，Smad2/3信号通路也与体外培养过程中软骨细胞的成熟和肥大有关[17]。缺乏Smad3的突变小鼠可出现软骨退行性疾病，而TGF-β1不足的小鼠可出现骨关节炎[1]。神经白细胞介素(interleukin,IL)及其受体共同上调磷酸化Akt和磷酸化Smad2/3并下调磷酸化Smad1/5，通过多种途径协同促进软骨细胞的增殖和维持软骨细胞表型[17]。红景天甙等一些中药成分也可提高TGF、Smad3和软骨特定基因的表达，促进软骨细胞增殖和基质合成，下调ColⅠ表达[18]。

抑制TGF-β1表达可导致软骨细胞衰老和去分化。氨基酰转运RNA合成酶复合酶相互作用多功能蛋白质1(aminoacyl-tRNA synthetase-interacting multi-functional protein 1,AIMP1)是TGF-β信号负反馈循环中的成分之一，AIMP1的胞内定位可能与维持软骨细胞特性的信号传导有关，其过表达可在胞质抑制TGF-β介导的Smad2/3磷酸化和核转移[17]。综合应用AIMP1小干扰RNA 和TGF-β可明显地增加胞核Smad2/3信号的磷酸化水平，促进体内软骨形成，减轻细胞肥大化[19]。细胞迁移诱导和透明蛋白(cell migration-inducing and hyaluronan-binding protein,CEMIP)在去分化软骨细胞中呈高表达，可降低TGF-β的表达水平，诱导纤维化样过程[20]。CEMIP可改变软骨细胞的胶原表达谱(高表达CEMIP的软骨细胞，其Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ型胶原蛋白的mRNA表达增高，而Ⅱ、Ⅵ、Ⅸ和Ⅺ型胶原蛋白的mRNA表达降低)，表明CEMIP可以促使软骨细胞表型向成纤维细胞样表型转换，促进软骨细胞去分化[18]。CEMIP可调节编码PAI-1的SERPINE1基因，而PAI-1是TGF-β信号中的磷酸化Smad2/3通路的下游调节因子，可促进软骨细胞向成纤维细胞转化；此外CEMIP缺失还可诱导周蛋白合成和分泌降低，在骨关节炎中，周蛋白可强化炎症反应并增加金属蛋白酶产生[21]。

3.1.2 BMP：BMP信号通路也是软骨形成的重要调控和诱导因子。与TGF-β1相似，BMP-2可通过复杂的下游信号传导机制激活目标基因的转录，促进前列腺素合成，修复受损的软骨；BMP-2可激活BMP受体1A(或ALK3)、BMP受体1B(或ALK6)和各种Smad通路，对维持软骨细胞形态和生长发育至关重要；BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-9和BMP-13也有助于维持软骨细胞的分化状态，并在体外实验中诱导间充质干细胞的软骨形成[1]。BMP-2/BMP-4的同源物已经在软体动物的壳中得到鉴定，其中一种蛋白具有egf样结构域，因此推测软体动物壳来源的一种或多种蛋白具有类似BMP的功能[22]。从大菱角扇贝壳中提取的水溶性基质存在BMP样效应，可以增加聚蛋白多糖和ColⅡ的表达，但不提高ColⅠ的表达[22]。与BMP结构相似，激活素也是TGF-β超家族的成员。激活素A对其Ⅱ型受体表现出很高的亲和力，可激活Smad2/3转录因子，而BMP-2对这些受体的亲和力较低，但对其Ⅰ型受体的亲和力较高，可激活Smad1/5/8转录因子[23]。有研究通过部分嵌合体和异构体的随机组合(random assembly of segmental chimera and heteromers，RASCH)构建了一系列BMP-2和激活素A序列的系统交换嵌合配体，其中AB235嵌合配体可以明显地促进脂肪干细胞向软骨细胞分化[24]，并诱导去分化的软骨细胞再分化，效果优于单独使用BMP-2[25]。通过开发新型TGF-β嵌合配体获得的RASCH策略有助于扩展TGF-β超家族配体功能库，充分开发TGF-β超家族的多种生物作用[26]。然而，由于各研究所使用的模型系统和培养条件不同，关于BMP的相对效力仍存在争议。

总之，TGF-β家族成员是软骨细胞去分化过程中的重要成分。软骨中的信号传导既依赖于Smad通路，也可不依赖于Smad而发挥作用。然而，老化细胞如何影响细胞环境，如何调节TGF-β和BMP软骨信号，目前仍未完全阐明。Tseng等[27]采用低剂量的碱性成纤维生长因子实现了500倍以上的耳郭软骨细胞扩增(在第3代培养时)，但是ColⅡ的表达下降，产生去分化现象；在三维培养中联合应用BMP-2与碱性成纤维生长因子可显著提高ColⅡ和聚蛋白多糖的表达，而在单层培养时其对ColⅡ和聚蛋白多糖则没有影响。因此，进一步研究TGF-β超家族成员在软骨细胞去分化中的分子机制有助于了解软骨细胞去分化的进展。

3.2 Wnt信号通路 Wnt是软骨发育、间充质细胞软骨分化、软骨细胞增殖成熟和软骨分解代谢的重要通路。“经典”和“非经典”Wnt通路的交联和协同作用为理解这些通路在调节软骨细胞表型中的作用和复杂性提供更多的方向。

3.2.1 经典的Wnt信号通路：经典的Wnt信号通路中，Wnt蛋白与卷曲蛋白-低密度脂蛋白相关蛋白复合受体5/6受体复合物结合，磷酸化激活胞质内散乱蛋白，散乱蛋白能切断β-连环蛋白降解途径，使降解复合体糖原合酶激酶-3β、轴蛋白、结肠腺瘤性息肉病蛋白、酪蛋白激酶1解散，β-连环蛋白在细胞质中积累而进入细胞核，与T细胞因子/淋巴样增强因子相互作用，调节靶基因表达[11]。经典Wnt信号通路对软骨细胞产生的效应取决于培养环境和Rho的活性。Öztürk等[11]研究了RhoA和经典Wnt信号通路交联在软骨细胞表型中的作用，结果显示，在Rho激活的状态下，使用氯化锂激活Wnt信号通路可导致ColⅡ表达降低，聚蛋白多糖减少，而在Rho未激活的状态下，氯化锂则可引起软骨细胞再分化。

RhoA是研究最广泛的Rho鸟苷三磷酸酶，可调节大量的细胞过程，其亚细胞定位是调节不同信号通路的重要因素[28]。软骨细胞去分化伴有RhoA的表达上调和核转移，抑制Rho通路可以抑制RhoA核转移，发生软骨基质积累[11]。这种核转移现象可能参与心肌素相关转录因子及其血清应答因子诱导的软骨细胞去分化标志物上调，也可能参与心肌蛋白介导的Sox-9活性抑制和软骨基因表达下降。在Rho鸟苷三磷酸酶的支配下，β-连环蛋白、Yes 相关蛋白(Yes-associated protein，YAP)及含有PDZ结合基序的转录共激活因子(transcriptional co-activator with PDZ-binding motif，TAZ)受细胞外基质动力学和细胞形状调节，是软骨细胞力学信号的重要传递者；在Rho影响下，YAP/TAZ受到机械刺激而发生核转移，进而抑制软骨形成[11]。心肌素相关转录因子及其血清应答因子通路可以与YAP/TAZ共同作用，激活Rho介导的CTGF、ANKRD1等靶基因的转录[29]。在软骨细胞去分化的过程中，RhoA核转移与经典的Wnt信号通路正常、β-连环蛋白累积以依赖于Rho的模式伴随发生。值得注意的是，随着软骨细胞去分化、RhoA核转移以及β-连环蛋白激活，轴蛋白2表达显著降低，并出现核转移现象，这提示轴蛋白2的表达可能受轴蛋白2自身核转移的调节[11]。轴蛋白2基因是β-连环蛋白/T细胞因子/淋巴样增强因子复合体的靶基因，可以增强TGF-β信号，介导TGF-β和Wnt/β-连环蛋白之间的交联[30]。敲除轴蛋白2基因的小鼠软骨细胞ColⅡ表达降低，ColⅩ表达增高，并出现软骨细胞肥大化现象[31]。对这种交联和协同作用的研究将为理解这些通路在调节软骨细胞表型中的作用和复杂性开辟更多的方向。

上述研究结果提示，不同环境中软骨细胞去分化存在差异性，未来的研究需要更深入地了解RhoA核转移和经典Wnt信号通路效应物激活的机制，以及不同环境背景下，RhoA核转移和经典Wnt信号通路在软骨细胞标志物丢失中的作用。

3.2.2 非经典的Wnt信号通路：与上述经典的Wnt信号通路机制不同，非经典的Wnt信号通路可激活卷曲蛋白6/散乱蛋白2/多配体蛋白聚糖4(Syndecan 4，SYND4)/钙离子钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱα(calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱα，CaMKⅡα)/B亚型Raf激酶(B-Raf)/细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)1/2级联而诱导软骨细胞去分化[32]。Wnt-3a是Wnt信号通路的重要激活蛋白[33]，在Wnt-3a的影响下，卷曲蛋白6触发CaMKⅡα与SYND4、B-Raf及散乱蛋白2的对接，导致体内外B-raf被CaMKⅡα磷酸化，激活ERK1/2，从而导致软骨细胞去分化[32]。该研究表明非经典Wnt信号通路通过激活ERK1/2导致软骨表型丢失，提示CaMKⅡα和B-Raf在软骨细胞去分化中具有直接关系，通过激活CaMKⅡα的B-Raf/ERK1/2通路，卷曲蛋白6可介导Wnt-3a所致的软骨表型丢失。新发现的软骨表型调节因子卷曲蛋白6、SYND4和B-Raf或可作为对抗去分化的潜在靶点。

3.3 IL-1β IL-1β可抑制软骨细胞增殖，诱发去分化[16]。IL-4、白藜芦醇、黄芩苷等可以减轻IL-1β造成的去分化，抑制软骨细胞凋亡，增加软骨细胞的合成[34]。传代培养的去分化软骨细胞中，IL-1β水平升高，IL-1β可刺激B-Raf，促进丝裂原活化细胞外信号调节蛋白激酶(mitogen-activated extracellular signal regulated kinase,MEK)1/2和ERK1/2磷酸化并抑制软骨细胞的增殖，但无法促进Sox-9和血管内皮生长因子的表达；通过MEK1/2 和 ERK1/2通路，IL-1β可以激活蛋白聚糖酶分解聚蛋白多糖[1]。IL-1β还可激活蛋白聚糖酶，促进软骨细胞的去分化过程[35]。在IL-1β诱导的软骨细胞中，USP14去泛素化酶上调，这种上调过程依赖于核因子κB(nuclear factor kappaB，NF-κB)通路的激活，且反过来进一步激活NF-κB通路，从功能上加剧IL-1β对软骨细胞去分化的影响；NF-κB未激活时在胞质中和NF-κB抑制蛋白相结合，被IL-1β等各种化学和机械信号激活后，NF-κB抑制蛋白激酶可磷酸化NF-κB抑制蛋白α，致其通过泛素蛋白酶系统降解，致使NF-κB转移入核并导致一系列细胞因子、趋化因子和蛋白酶等因子变化，参与骨关节炎病理过程；USP14可促进上述NF-κB抑制蛋白α的去泛素化过程，加速了蛋白酶对其降解，抑制NF-κB则可以显著逆转这种去分化过程[36]。这一发现揭示了IL-1β或可通过影响USP14而改变NF-κB来对抗去分化。Varela-Eirín等[37]发现了一个连接蛋白43敏感循环，其可通过促进Twist-1的核转移导致软骨细胞去分化，还可导致软骨细胞老化以及相关的p53/p16高表达、NF-κB核转移，抑制连接蛋白43表达或阻断缝隙连接通讯功能可以逆转去分化过程，提高ColⅡa1的合成，揭示了一个软骨细胞去分化调节的新模式，IL-1β可能是这一连接蛋白43循环的反馈促进因子。

3.4 p38丝裂原活化蛋白激酶 p38是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族的重要成员，可通过代谢改变和基质降解来改变软骨细胞的表型[38]。ERK和JNK是调节p38 MAPK的两个上游信号因子。单层培养中抑制p38 MAPK可导致ColⅡ表达上调，ColⅠ表达下调[1]。哺乳动物的沉默信息调节因子2相关酶类(sirtuins，SIRT)具有NAD+依赖性脱乙酰酶和ADP核糖基转移酶活性，对α糖微管蛋白、组蛋白和叉头蛋白等多种细胞骨架蛋白发挥去乙酰化作用。人类Sirtuin家族中公认的成员有7个：SIRT1～SIRT7。Eo等[17]使用PEP-1多肽携带的SIRT2作用于关节软骨细胞，发现环氧合酶2和前列腺素E2等炎性指标升高；SIRT2可通过ERK通路增强软骨细胞去分化，通过ERK和p38通路促进炎症反应。进一步研究提示SIRT2磷酸化可激活ERK通路，促进金属蛋白酶1和金属蛋白酶13表达[39]。谷氧还蛋白1(glutaredoxin 1，GRX-1)属于氧化还原酶家族，是内源性抗氧化防御系统的组成部分。GRX-1可通过内质网应激依赖性ERK-1/2通路、内质网应激依赖性p38激酶通路和PI-3激酶通路诱导兔关节软骨细胞去分化[40]。GRX-1增加了Akt、ERK1/2和p38的磷酸化，软骨细胞内质网应力相关蛋白GRP78和GRP94升高。然而，由于体外分析的局限性，软骨细胞内质网应激受GRX-1调控的确切机制尚不清楚。细胞因子诱导的凋亡抑制因子1在去分化软骨细胞中激活ERK-1/2，使p38激酶失活，通过抑制ColⅡ的表达和硫酸蛋白多糖的合成而导致去分化。MEK抑制剂消除凋亡抑制因子1诱导的ERK磷酸化，同时阻止凋亡抑制因子1诱导的ColⅡ表达的丢失[41]。此外，Ashraf等[42]还发现在大脑中富集的Ras同源基因可通过调节衰老、去分化和氧化应激来维持软骨细胞的固有特性，其机制可能与p38 MAPK有关。这些信息有助于了解软骨细胞去分化的分子机制，帮助设计更多的对抗去分化的新方法。

4 其他方面

除了上述基因方面外，支架材料、形态、黏附锚定等与软骨细胞去分化的关系研究也取得了很多新进展，软骨细胞在去分化过程中的形态和黏附[43]改变也与其表型密切相关。一些新型支架材料可以通过改变软骨细胞去分化过程中的形态变化[44]和黏附锚定方式[45-46]来改变软骨细胞去分化表型。新型DNA纳米材料DNA四面体结构纳米材料可通过调节微管和Notch信号通路来调控细胞功能[47]。代谢方面，软骨细胞天然生活在缺乏血供的环境中，能很好地适应低氧张力，线粒体质量和氧需求较低，因此谷氨酰氨转氨酶2的下调可通过促进葡萄糖代谢，参与去分化软骨细胞的再分化[48]。新型药物方面，眼镜蛇神经肽[49]、原儿茶酸[50]、龙眼多糖[51]能有效地促进软骨细胞增殖，维持人关节软骨细胞表型。培养条件方面，通过改变温度[52]和培养密度[53]，软骨细胞能更好地维持软骨表型。Rakic等[13]综合应用多种方法模拟软骨微环境，发现三维缺氧细胞培养、BMP-2和RNA干扰联合作用，可使去分化的软骨细胞有效再分化。

5 小 结

目前软骨细胞去分化机制在各个方面的研究进一步深入，软骨细胞去分化标志物的进一步丰富，有助于我们从多角度、多层面理解和测定软骨细胞去分化的状态。甲基化[8]、乙酰化[17]等表观遗传学改变在软骨细胞去分化中的作用被进一步挖掘，抑制DNA甲基化是维持软骨细胞表型的新方法，位点特异性启动子甲基化或去甲基化必须得到优化。表观遗传分析和生物信息学分析[8]是识别软骨细胞去分化区域特异性DNA甲基化的有力策略。对经典Wnt信号通路和Rho信号的交联研究有助于进一步明确软骨细胞的骨架变化与去分化之间的关系。此外，非经典的Wnt信号在软骨细胞去分化中的作用得到挖掘并逐渐受到重视，更加丰富了Wnt信号通路在软骨细胞去分化机制中的作用。IL-1β、p38 MAPK等是传统的软骨细胞去分化促进因子，在关节炎等软骨炎症或传代培养中严重影响软骨细胞表型的维持，USP14前馈、连接蛋白43循环等有助于揭示促进去分化的回路，以及进一步理解软骨细胞去分化的促进过程，从而找到新的去分化机制以及对抗去分化的作用靶点。