补体激活与自噬在年龄相关性黄斑变性中的研究进展

刘雨露，徐新荣

0引言

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,ARMD)通常也称为老年性黄斑变性，是导致全世界老年人视力减退甚至丧失的最主要原因之一[1]，目前全世界成年人的患病率大约在3%左右，预估到2040年将会影响全球近2.88亿人[2]。ARMD可分为干性和湿性两种，与湿性ARMD相比，干性ARMD的发病机制更为复杂，其形成与脂质代谢和运输调节、细胞外基质重构、细胞粘附、细胞毒性、细胞死亡和血管生成有关，特别是与炎症密切相关，而补体系统异常激活容易引起免疫炎症。近年研究表明，自噬功能异常与干性ARMD的发展也密不可分。补体激活与自噬失调相互影响，加速视网膜细胞的凋亡，促进ARMD的发生、发展。本文就补体激活与自噬过程在ARMD发展中的作用作一综述。

1补体激活及自噬的概念

1.1补体系统及补体激活补体是存在于人和动物的体液中以及细胞表面，经活化后具有生物活性，能够介导免疫和炎症反应的蛋白，也称为补体系统，包括30余种可溶性蛋白和膜结合蛋白。补体系统几乎参与了机体中所发生的特异性及非特异性免疫机制。它在防御病原、清除免疫复合物和凋亡细胞及适应性免疫反应中发挥关键作用。补体系统的激活途径主要有3种，即经典、替代(旁路)和凝集素(MBL)途径。3条激活途径均可产生C3转化酶，进而导致C5b-9(膜攻击复合物MAC)生成，使细胞溶解从而产生免疫学作用。补体系统过度激活产生免疫炎症反应，能使自身组织遭到破坏。

1.2自噬自噬是细胞通过溶酶体途径，将细胞内受损的细胞器或错误折叠的蛋白质降解小分子或氨基酸，对某些蛋白质和氨基酸再回收、再利用的过程[3]。以细胞内底物进入溶酶体途径的不同为依据，自噬主要分为3种：巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)，其中巨自噬又可分为选择性自噬以及非选择性自噬[4]。自噬过程由起始阶段、分隔膜形成阶段、自噬体形成阶段、自噬溶酶体形成及降解阶段4个阶段组成。自噬信号调控的准确性对于细胞的存活以及应对各种应激尤为重要，其调控机制相当复杂。目前的研究表明，泛素样蛋白系统、mTOR、磷酸腺苷活化蛋白激酶及PI3K途径对于调控自噬起到重要作用[5]。

2补体激活及自噬与ARMD

2.1补体激活与ARMD实验表明补体系统与ARMD关系密切[6]。补体失调参与了ARMD的发病过程，尤其是补体旁路系统的失调。补体旁路系统作为补体系统的一部分，能够产生与ARMD相关的多种蛋白质。随年龄增长，视网膜处理高代谢产物的能力也随之下降，导致脂质、补体(如C3、C3a)以及其他免疫物质在视网膜下堆积，导致补体系统激活，形成玻璃膜疣[7]。玻璃膜疣是视网膜色素上皮(RPE)和Bruch膜之间的疣状沉积物，与光感受器细胞和RPE细胞的变性有关，它是ARMD的临床标志，是ARMD发病的重要因素[8-10]，随着疾病的发展，其大小和数量也在逐渐增加。玻璃膜疣的形成是导致严重的不可逆性中心性盲的主要原因，严重影响人们的日常生活[9]。不同补体成分，包括C3、C5b-9、CFB和CFH，在drusen和ARMD病变[11]中均有发现。研究还显示，ARMD患者血浆中C3a、C3d和C5a水平升高[12-13]。β-淀粉样蛋白(amyloid-β-protein,Aβ)是玻璃膜疣的重要组成成分之一。Zhao等[14]在小鼠体内发现，随着小鼠年龄增长，Aβ在RPE层的表达增多，随之诱导膜攻击复合物(MAC)表达增多，介导固有免疫系统引起炎症反应。丛生蛋白也是玻璃膜疣的主要蛋白成分之一，研究表明，ARMD患者眼中丛生蛋白的含量远大于正常人眼组织中的含量[15]。丛生蛋白可以通过调节补体系统而参与炎症反应过程，并且与炎症反应密切相关。Johnson等[16]将RPE细胞用富含补体成分的血清孵育后建立了一种模拟ARMD的体外模型,这种模型模拟了ARMD形成过程中一些关键特征,包括RPE下沉积物的聚集,即玻璃膜疣的成分和补体系统终末激活物以及大量的丛生蛋白沉积,由此推断丛生蛋白与补体经典途径的激活有关。

曾在2005年，同时发表在Science杂志上的3篇文章均与ARMD的遗传学基础研究有关，这些研究均提示补体因子H(CFH)的多态性与ARMD有密切联系[17-19]。ARMD发生的主要预报因子是补体因子H基因常见的变异体Y402H[20]，该变异体能够对其调节免疫系统方面起到抑制作用，从而过度激活补体，形成玻璃膜疣，损坏Bruch膜，引发湿性ARMD。Hageman等[21]报告显示影响ARMD敏感性的不仅是Y402H单一基因变异，而且是CFH不同区域组成的半倍体型变异。这提示多样的补体因子H的变异会导致ARMD风险上升或下降。

2.2自噬与ARMD自噬在视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞的功能中起着关键作用[22-24]。RPE细胞是有丝分裂后非自我更新的吞噬细胞，这些细胞内成分的自噬对维持正常细胞功能至关重要。最近研究发现，野生型小鼠的视网膜，特别是RPE和光感受器的自噬水平维持在一个较高的基线水平，而光照会引起自噬反应[25]。在ARMD初期，为了补偿损坏的细胞器和氧化应激的结果，自噬水平增长。在人体ARMD样本和小鼠ARMD模型中，RPE和视网膜层中LC3、ATG9、ATG7水平升高[26]。然而，在来自晚期ARMD的样本中，LC3、ATG9和ATG7水平下降，我们认为缺乏自噬活性导致了ARMD的恶化。N-视黄醇胺(N-retinylidene-N-retinylethanolamine,A2E)存在于老年患者的RPE细胞中，是一种主要的毒性脂褐素成分。Zhang等[27]发现，在ARMD早期，A2E可触发RPE细胞自噬，RPE细胞自噬水平升高，通过减少炎症细胞因子和VEGF的分泌，保护细胞免受A2E的有害影响。自噬水平的降低使RPE细胞容易受到各种应激诱导的凋亡，包括营养耗竭和线粒体氧化损伤。p62是自噬降解的一种选择性底物蛋白，具有靶向导向、信号调节、组装蛋白质复合物和调节细胞凋亡等作用[28]；p62还可影响由keap1/Nrf2通路调节的氧化应激反应。研究表明，通过自噬清除不溶性蛋白质及Nrf2信号通路的激活从而发挥抗氧化功能，p62为RPE提供双重保护[29]。内源性p62的耗尽通过下调自噬相关基因Atg1，降低自噬活性，进而使RPE更容易受到氧化损伤，即在疾病状态下自噬活性被抑制，导致p62堆积，从而加重ARMD的进展[30]。

3补体激活与自噬相互影响

3.1自噬调节免疫炎症补体系统异常激活导致免疫炎症反应，破坏自身组织；而自噬作为一种自我保护机制，是维持细胞稳态的一个重要途径，在调解免疫炎症方面起到重要作用。在关于巨噬细胞的实验中，Shi等[31]研究发现自噬可以减轻免疫炎症反应的发生，其过程是通过降解炎症小体的组成成分以抑制NLRP3炎症小体的激活。有研究表明，ARMD病程中可能与自噬代谢累积物p62的沉积相关，其毒性反应对RPE细胞产生损伤作用[32]。在ARMD患者的黄斑组织中也出现自噬体及NLRP3等炎性因子累积[33]。说明自噬功能失调可加重免疫炎症反应。

3.2补体激活与自噬对RPE细胞的影响膜攻击复合物(MAC)是补体激活的终产物，它已被发现存在于ARMD患者的黄斑区及玻璃膜疣中，以攻击RPE细胞为目标，并可促进跨膜通道的形成，进而导致RPE细胞的死亡[34]，而抗氧化、抑制补体激活能减轻RPE细胞损伤[34-35]。在如缺氧、炎症、氧化应激或非折叠蛋白反应等应激环境中，RPE细胞的自噬可以被激活[36-37]。Lee等[38]通过研究观察到线粒体膜中PINK1的积聚,并综合电镜等的检查结果证实了RPE细胞的损伤能够导致线粒体自噬增加,并保护细胞,以及预防RPE细胞的损失。Wang等[39]在实验中观察到由线粒体铁蛋白(FTMT)过表达的ARPE-19细胞线粒体分裂增强,引起线粒体自噬的触发,促进保护机制的形成以应对氧化应激和与应激相关的其他损失。以上研究表明，补体激活导致RPE细胞死亡，而自噬则对RPE细胞起保护作用。

3.3均衡调节补体激活和自噬的作用keap1/Nrf2是人体最为重要的抗氧化应激防御性通路。p62是自噬过程的重要调节蛋白。Hayashi等[40]研究发现，在听觉细胞，自噬在氧化应激时通过p62蛋白维持与Nrf2系统的信号串扰；Mizunoe等[41]研究结果显示，海藻糖能诱导自噬，还可激活p62-keap1/Nrf2通路，有望用于治疗氧化应激和自噬功能障碍导致的许多慢性疾病。氧化损伤直接激活或者通过Nrf2通路激活均可导致补体系统的激活。因此，keap1/Nrf2通路与补体激活和细胞自噬过程关系密切。自噬对细胞具有保护作用，但过度上调也会加重细胞凋亡；而补体激活形成的膜攻击复合物会裂解细胞，激活过程产生的活化片段可介导炎症反应，引发各种病理生理改变，但抑制补体激活会导致免疫防御功能的下降，甚至使肿瘤细胞逃避攻击。这启示我们，单纯上调自噬或抑制补体激活对氧化应激诱发的细胞损伤的保护作用是难以评估的，均衡调节补体激活和自噬是是防治ARMD的关键所在，而P62蛋白作为keap1/Nrf2通路的重要调控因子，可能作为补体激活和自噬活动的调节者，为维护细胞内稳态起到关键作用。

4小结

补体系统保持低烈度激活和正常的自噬是机体应对老化、变性、变异和各种有害物质侵袭的重要途径。虽然我们对补体激活及自噬与ARMD的关系的探索已取得一定进展，但ARMD的发生受年龄、遗传、吸烟、氧化应激等诸多因素的影响，是多个机制共同作用的结果。发病机制的研究是临床治疗的理论基石。针对补体因子的生物制剂还处于研发当中，尚未进行大规模临床应用；对自噬程度的靶向调控还未取得全部突破，自噬过少影响细胞的正常功能，自噬过强则能导致自噬性死亡。因此，我们需进一步明确各种补体、炎症因子激活的诱导因子及各因子间相互作用机制，以平衡补体激活与自噬之间的关系；其次，基于P62蛋白的特有功能，我们需深入研究调控P62蛋白可能通过keap1/Nrf2通路调节补体激活和自噬活动，为防治ARMD做好理论基础和准备。