石油烃类污染物的微生物修复研究进展

崔倩倩，刘朝阳

(1.中冶华天工程技术有限公司，210019，南京；2. 中国科学院南京土壤研究所，210008，南京)

0 引言

石油工业是重要战略能源与国民经济命脉，受到全世界各国极度重视。然而随着石油工业快速发展，石油污染问题逐步引起人们广泛关注。在石油开采、炼制、加工、运输及使用过程中出现的原油泄漏与溢油事故，严重污染了当地土壤和水体。石油污染会破坏土壤结构和功能，从而影响其透气性和渗水性，造成土壤肥力下降、土壤板结等问题；石油漂浮在水面会形成油膜，造成水体溶氧量降低，影响水生生物生长发育甚至造成缺氧死亡，严重破坏水生生态系统；同时石油及其产品中的一些挥发性成分可与大气中的颗粒物结合，伴随着降雨或者降尘进入土壤和水体中，导致石油污染传输扩散。据估计全世界每年约有 10亿 t石油及其产品进入地下水、地表水及土壤中，对自然环境、人体健康、水产养殖等方面造成了严重影响[1]。

石油是一种多成分复杂化合物，由多种烃类和非烃类组成，烃类物质是石油主要成分，约占石油总成分的95%～99%。按照化学结构，石油烃类物质可分为烷烃、环烷烃、芳香烃等几种类别，其中烷烃占石油中含量的50%～95%，为石油烃中主要成分[2-3]。近年来随着环保意识的加强，绿色高效、无二次污染、对环境友好及成本低廉的微生物修复技术得到重视，逐步被国内外广泛应用与关注。

1 可修复石油烃类污染的微生物种类

据报道已有100多个属200多种可降解石油烃的微生物被发现。报道较多的微生物种类有细菌(不动杆菌属、芽孢杆菌属、产碱杆菌属、假单胞菌属、无色杆菌属等)、真菌(金色担子菌、红酵母属、假丝酵母属等)、放线菌(分支杆菌属、诺卡氏菌属、放线菌属等)、酵母等；其中细菌分离得到的种类最多、应用最广，一般认为比其他菌属的石油降解效果更好[4]。微生物降解石油烃是需要多种微生物协同作用的复杂过程，可培养的微生物在自然界中仍占少数，所以可降解石油烃的微生物筛选、分离和培养是当前研究的热点课题。

发生石油污染后，石油烃降解菌能比较快速地适应受石油污染的环境，并进行大量繁殖，聚集形成降解效率较高、修复能力较强的微生物菌群[5-6]。1989年美国阿拉斯加威廉王子湾发生邮轮泄漏3.55 万t原油入海洋后，Braddock[7]等连续3年发现石油烃降解菌数量在油膜覆盖区域远高于非油膜覆盖区域。El-Sheshtawy[8]等从被石油污染的埃及红海吉萨湾分离得到15种石油烃降解菌。利用石油烃降解菌能够快速响应石油污染的特性，通过特定石油烃基质富集培养、诱导等人工方式可以获取丰富的石油烃降解菌资源，这些微生物的活性和降解能力均优于非石油污染区域的微生物。李晓娜[9]等从山东省东营市胜利油田附近被石油污染的土壤中分离得到两株高效降解菌，经鉴定为芽孢杆菌和假单胞菌，2株菌对石油的降解率分别可达到72.3%和61.2%，具有应用于石油类污染修复的潜力。

2 石油烃污染的微生物修复技术

微生物修复技术已被广泛应用于治理石油烃污染。微生物可以烃类化合物为能源，在正常生理代谢过程中降解石油烃类污染物。微生物修复技术一般分为原位微生物修复和异位微生物修复2种。原位微生物修复是直接利用微生物在发生污染的区域进行修复；异位修复则是将受污染的物料转运至其他地方，再通过微生物进行修复的技术[10]。与异位微生物修复相比，原位微生物修复是一种低维护、低成本、环保且可持续的治理方法。

2.1 生物强化技术

外源添加经过筛选驯化的高效降解菌或者直接将降解菌接种到受污染的区域，在适宜微生物生长代谢的环境条件下用于降解石油烃类物质的技术被称为生物强化技术[11]。该技术中所用高效降解菌种一般都从受石油烃污染样品驯化筛选得到，具有适应性强、可持续发挥修复作用的特点，具有较好修复能力。生物强化技术主要包含外源投加高效降解菌同时增加营养物质、表面活性剂、增加曝气量等措施。虽然该技术在石油烃类污染治理中表现出较好的效果，但是容易受环境条件和土壤理化性质影响，在应用上有一定的局限性[11-12]。研究更高效的生物强化配套措施是未来主要发展趋势。

2.1.1 投加外源微生物 在外源加入石油烃降解菌时，需要考察外源微生物与土著微生物的关系，考虑选择相容性好，与土著微生物之间可发挥协同互补关系，避免外源微生物与土著微生物之间存在竞争关系，助力降解菌株发挥最大修复潜力[12]。最常用的方法是将从石油污染的样品中筛选得到的降解菌制成微生物菌剂外源投加进行修复。隋红[13]等通过投加研发的微生物菌剂进行土壤修复试验，经过2个月的修复处理，受污染的土壤中总石油烃含量由334 mg/kg降为91 mg/kg。Alisi[14]等外源投加由10种石油烷烃降解菌组成的微生物菌剂ENEA-LAM可降解土壤中75%以上的柴油，具有较好的处理效果。Yu[15]等将筛选得到的枯草芽孢杆菌和多食鞘氨醇杆菌制备成微生物菌剂用于胜利油田的石油污染修复，污染土壤经过2个月的处理，可去除67.7%的石油，具有显著的修复效果。

2.1.2 强化土著微生物 相比于外源投加降解菌进行污染修复，强化土著微生物具有更强的适应性，一般能更好地发挥降解能力，取得更好的降解效果。常用的强化土著微生物措施包括施加营养物质、增加溶氧量等。Fodelianakis[16]等将具有降解能力的菌株加入某炼油厂被污染的土壤中，并与土著微生物的降解效果进行了比较，结果发现外源添加的微生物降解效果并无提高，外源微生物存活率较低，而土著微生物降解效果明显。Ma[17]等将从炼油厂被污染的土壤中筛选分离出到6种土著高效石油降解菌混合处理污染土壤，经过84 d处理去除率达63.2%±20.1%，是自然降解的3～4倍。

2.2 生物刺激技术

为土著菌提供适宜的环境条件使土著菌能更好地生长代谢和快速繁殖，从而提高石油烃类污染物的降解修复效率，该技术被称为生物刺激技术[11]。在工程上常用的生物刺激措施包括投加表面活性剂、外加营养物质等。

2.2.1 表面活性剂 石油类因为很强的疏水性从而限制微生物与其作用面积，表面活性剂能促进石油烃乳化，增加微生物的亲油性，增加微生物在油水界面进行降解反应，提高降解效率。生物表面活性剂比化学表面活性剂更有优势，可以被微生物降解，不会造成二次污染，并且具有好的pH稳定性和热稳定性。曹娟[18]等从石油污染物中筛选到一株降解菌BHSN，经研究表明这株菌不但有较高降解能力，而且还能产生表面活性物质，从而避免外加生物表面活性物质对降解菌产生抑制作用。Kaczorek[19]研究了生物表面活性剂鼠李糖脂对石油烃类降解菌假单胞菌降解柴油的影响，结果表明鼠李糖脂明显提高了柴油的降解率，14 d后的降解率为88%，而没有添加表面活性剂的降解率为54%。Liu[20]等研究了不同浓度的表面活性剂对热带假丝酵母降解十六烷烃的影响，结果在所有测试浓度下均可增加其降解率。Wang[21]等用生物表面活性剂处理土著微生物后治理海洋沉积物中石油烃污染，结果石油烃的降解率为 51.29%，比未经处理的菌株降解率提高了17.8%。

2.2.2 营养物质 虽然石油烃类污染给微生物提供了较为充分的碳源，但微生物生长代谢也需要磷、铁、氮、镁等营养物质才可顺利进行。Venosa[22]等对发生溢油事故的沙滩进行污染修复，在添加营养物质后，烷烃生物降解半衰期由原来的4周变为2周，石油烃污染物的降解率明显提高。Oh[23]等研究了施加无机缓释肥对石油类降解菌修复的影响，发现营养物质与降解菌的浓度、微生物活性和降解效率有密切的关系。吴蔓莉[24]等将筛选得到的降解菌与堆肥剂修复被油污污染的土壤，在低温环境中经过处理30 d，总石油烃去除率27%，比自然降解率高得多。

2.3 固定化微生物技术

固定化微生物技术指将从自然界中筛选分离得到的或者经过培养驯化的游离微生物，利用物理或者化学方法将其固定在限定的空间内来增加微生物的密度并保持生物活性，从而提高石油烃类污染物降解能力的技术[25]。固定化微生物技术可为微生物提供有利环境，使微生物得到快速繁殖，增加降解菌株的有效浓度。此外，降解微生物产生的胞外酶可以在具有吸附能力的固定化载体上富集，提高降解修复效率。同时固定化材料还可以为土著微生物的富集驯化提供场所，使外源微生物与土著微生物可以共同发挥修复能力，提高污染物的降解率[26]。该技术具有反应条件易控制、效率高、微生物不易流失等优势。卢迪[27]将筛选得到的微生物固定化到陶粒活性炭载体上对加油站石油烃污染土壤进行原位修复，所筛选的菌株在20 d内对石油烃降解率在40%以上。刘虹[28]等将筛选的高效降解石油烃菌株微嗜酸寡养单胞菌按载体(稻壳木屑硅藻土)比例80%:10%:10%进行固定，降解效果最佳可达75.9%。

姜天翔[29]等利用海洋石油降解菌SI-JHS制成固定化小球治理含油海水，在优化条件下石油降解率高达97.8%，较游离菌提高了22.6%，经固定化后的降解菌效率得到显著提高。Liu[30]等选定海藻酸钙为固定化材料，经包埋处理的降解菌比游离菌降解效率提高1倍，最高降解率可达78%。刘志秀[31]研究了不同载体固定的石油降解菌的降解效果，对比发现柴油降解率从大到小依次为：玉米秸秆>木片>玉米叶>玉米棒>花生壳。其中，以玉米秸秆为载体的固定化菌20 d的柴油降解率为75%。该技术不仅可以使单位面积可用的微生物数量得到增加，某些有机材料还可为微生物生长提供氮、磷等必需营养元素，为微生物生长代谢与降解创造稳定的环境条件。

2.4 基因工程技术

虽然目前基因工程菌株应用在石油烃污染治理领域较少，但基因工程技术在石油烃污染治理方面具有很大的开发潜力[32]。在应用过程中，由于石油烃降解菌对底物具有一定的选择性，而不同的菌株间有可能存在竞争关系，从而影响修复效果[33]。针对以上问题，可利用基因工程技术将针对不同烃类的目的降解基因整合到一个菌株中，从而实现重组基因工程菌具有高效降解多种石油烃的能力。Chapracarty等将来自于假单胞菌属的4种降解性质粒导入到一个菌株中，该基因重组的工程菌株能同时降解芳香烃、多环芳烃和脂肪烃，而且能在几个小时后将自然降解需要一年以上才能降解的浮油去除[34]。2014年，谢云[35]利用转基因技术构建了一株不动杆菌属转基因工程菌BS3-C230，发现其具有降解底物广泛、酶活性较高、稳定性较高等优势，能同时高效降解石油烃中的烷烃和芳香烃组分。

3 微生物降解石油烃的影响因素

温度、pH、营养物质、氧气、石油烃种类等因素，对微生物降解石油烃类污染物影响较大。适宜温度有利于微生物的生长代谢，可快速增加降解微生物的浓度并且可以保持较高的降解活性。在一定的范围内随温度升高石油烃黏度和溶解度发生变化，从而增加微生物降解效率[36]。pH可影响细胞膜的通透性和稳定性，从而影响对营养物质吸收和石油烃降解速率。营养物质对生物降解影响较大，石油烃污染会给微生物提供较多碳源，但氮、磷等元素相对缺乏。因此，氮源和磷源是影响微生物降解效率的限制因素，添加适量营养物可以大幅提高生物降解效率。张博凡[37]等探究了不同条件下菌糠炭与固定化菌株苍白杆菌Q1对石油烃的降解效果，结果表明pH值和有机碳含量对微生物吸附-降解影响较明显。在生物降解过程中氧气可提供电子供体，保障降解反应顺利进行。在许多石油污染区，供氧不足往往成为制约降解的关键因素，据估算每分解1 g石油需氧气3～4 g[38]。不同种类的石油烃其生物可利用性和理化性质不同，降解效率不同。一般而言，相同条件下石油烃被微生物降解的难易程度为：直链烷烃>支链烷烃>环烷烃>多环芳烃>杂环芳烃[39]。

4 展望

虽然在石油烃污染的微生物修复领域已经取得了一些成果，但是仍存在一些问题制约其进一步发展。首先，相比于物理修复和化学修复，微生物修复石油烃污染的周期相对较长。微生物生长代谢需要一定的过程，另外石油中高分子量的烃类、树脂和沥青质等降解难度大，相应的修复效率也非常低。因此，筛选或研发高效的石油降解微生物已成为目前微生物修复石油烃污染领域的一个突出热点。此外，可积极探索微生物修复与传统物理或化学修复的协同耦合技术，发挥优势互补，最大程度协调优化修复过程中绿色、环保、经济、高效等问题。其外，需深入探索混合菌种在降解过程中相互促进或者抑制作用；基于不同微生物生长代谢的影响因素，优化经济高效的培养与发酵方法，开发适用性强的高效微生物菌剂，同时优化治理修复实施工艺，发挥最大修复潜能。此外，在今后的研究中应加强不同学科交叉研究，积极尝试新方法，尤其在DNA重组、分子杂交整合技术、质粒基因转接技术、分子物理与生物工程技术等方面的基础研究和实际应用。