多肽类药物防治缺血性脑卒中的研究进展

梁旭玲，邓莉，梁泉燕，朱艳

(广东医科大学寄生虫教研室，广东 湛江 524023)

0 引言

脑卒中是一组由于脑血管阻塞或爆裂而导致的脑血流中断所引起的脑损伤、身体残疾或多重功能损伤的临床综合症。缺血性脑卒中(ischemic stroke，IS)是临床上最常见的一种中风类型，其占卒中总数的60%～70%，具有高发病率、高致残率、高死亡率和高复发率的特点[1-2]。脑卒中已成为人类第二大致死致残率高的疾病和我国最主要的死亡原因之一，严重影响着人们的健康[3]。流行病学研究显示过去20年中，西方国家的中风发病率下降了42%，而我国同期却有增加的趋势[4-5]。尽早恢复缺血脑组织血液供应或再通仍然是临床上IS的首要治疗原则，但脑血管血流再通同时，可引起缺血脑组织进一步损害，临床症状进一步恶化，即引起缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury，I/R)。作为目前唯一被批准用于急性IS溶栓治疗的临床一线药物组织纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator，tPA)，由于只有3～4.5 h的狭窄治疗时间窗以及颅内出血风险评估，故只有3%～4%的中风患者可以接受其治疗。然而，IS是一个复杂的病理生理过程，其发病机制尚没有得到完全阐明，目前认为是氧化损伤、炎症、凋亡、自噬等多种复杂机制所导致的[6]，然而各种发病机制之间常常相互影响，共同主导IS的发生发展。

多肽药物是一类介于大分子蛋白/抗体类药物和小分子化学药物之间的药物类别，主要由10～50个氨基酸所组成。因其生物活性高、靶向专一性高、选择性高、毒副作用低等优点而被广泛应用于多种疾病的治疗[7]。近年来基因组学、蛋白组学等生物信息学研究方法兴起以及组合化学、高流通量筛查等多肽药物筛选方法的应用，越来越多的多肽类药物逐渐应用于多种疾病的诊断和防治。此外，微球、脂质体等药剂学新方法的应用大大提高了多肽类药物的成药性，如提高稳定性、延长体内半衰期等，促进了多肽类药物的新药开发[8-9]。多项临床前实验和临床研究表明，多肽类药物药效广泛，可用于防治IS、血栓性疾病、骨质疏松症等多种疾病[10-11]。目前，美国、欧盟等西方国家已批准了上百种多肽类药物上市[12]，并已显示出巨大的经济和社会效益[13]。除了tPA、尿激酶等几种蛋白溶栓药外，目前还没见防治IS的多肽类药物应用于临床，但临床前研究已发现较多的多肽类药物对IS的防治显示出理想的效果，且作用机制不限于溶栓。

1 IS的病理过程

按血流情况，IS的病理过程可分为2个阶段，分别为缺血期和再灌注期。第一阶段：由于大脑血管堵塞导致脑组织供血不足，能量代谢出现障碍，神经元细胞逐渐坏死，梗死灶开始形成，此时脑组织处于“零血流”的病理状态，即为缺血期[14]；第二阶段：缺血脑组织恢复部分血供，但血脑屏障(blood brain barrier，BBB)的通透性增加，自由基大量产生，氧化应激和炎症反应进一步加重。同时白细胞大量聚集并黏附于受损的毛细血管内皮上，堵塞微血管，血流无法通过，出现“零复流”现象，即为再灌注期[15]。“零血流”和“零复流”现象已成为IS的主要病理特点，同时是IS药物治疗面临的最大瓶颈。值得注意的是正常脑组织区域与梗死区域之间存在半暗带，半暗带是指具有潜在性或可逆性的脑缺血梗死灶的周边区域，即在治疗时间窗内恢复该区域的血供，脑组织还可恢复正常[16]。

按时间进程，IS的病理过程又可分为急性期，亚急性期和慢性期3个阶段。在急性期(数分钟至数小时)，缺血脑组织迅速产生大量促炎细胞因子、活性氧自由基(reactive oxide species，ROS)、趋化因子等，进一步激活并诱导内皮黏附分子的大量表达，从而促进血液中白细胞进入脑实质；在亚急性期(数小时至数天)，进入脑实质的白细胞释放大量趋化因子、细胞因子基质金属蛋白酶、ROS等炎症介质，加重脑部炎症反应和氧化损伤，最终导致BBB破损、脑水肿、神经细胞凋亡等病理变化，需要注意到的是有研究认为缺血后炎症反应可能参与了慢性期的功能恢复[17]；慢性期是指IS发生后的1～6个月期间[18]，卒中慢性期的幸存者中最常见的长期后遗症为血管性认知障碍、卒中后抑郁、运动障碍。有研究认为长期后遗症是由神经抑制因子、免疫激活、神经毒性等因素所导致[19]。

综上可知，IS是一个十分复杂的病理生理过程，梗塞后的脑组织损伤更是由多种复杂机制共同导致的。如血栓脱落所导致的脑缺血，因血流供应不足和能量代谢障碍，缺血区域神经元发生不可逆性坏死。在缺血半暗带中，能量代谢障碍可引起体内离子稳态失衡，导致大量的Ca2+内流，引起钙超载，进而诱导谷氨酸的过量释放，引起兴奋性氨基酸毒性的发生。过量释放的谷氨酸可与神经细胞谷氨酸受体结合引发线粒体钙超载及功能障碍，最终导致神经细胞的凋亡，同时Ca2+大量内流带动水分子被动内流，诱发神经细胞水肿；此外，激活的小胶质细胞释放大量的促炎细胞因子，诱导白细胞的浸润，从而诱发神经性炎症。炎症细胞同时产生过量ROS 和活性氮(reactive nitrogen species，RNS)，其反过来诱导炎症细胞，形成恶性循环。此外，随着血流和供氧的恢复，ROS和RNS可大量生成，加重损伤BBB，最终导致不可逆的脑组织损伤。

2 多肽类药物及作用机制

2.1 氧化损伤与多肽类药物

氧化损伤(oxidative damage，OD)是体内氧化还原状态失衡，即脑组织的抗氧化能力小于缺血所引起的一系列促氧化效应，从而引起的脑损伤。然而OD是机体长期积累的结果，特别是兼有高血压、糖尿病等疾病的IS患者，OD更加明显，更易发生IS[20]。此外，ROS在体内可作为信号分子引发炎症、凋亡等事件发生。正常人群脑组织中含有大量的不饱和脂肪酸，其中以亚油酸居多，不饱和脂肪酸容易被氧化，当机体出现氧化应激反应时，不饱和脂肪酸的氧化产物可对脑组织产生损伤，致使线粒体的三羧酸循环发生障碍，合成ATP的能力下降。当IS患者经过初步的溶栓治疗后，完成血液再次贯通，可引起进一步的氧化损伤，即缺血再灌注损伤。此时氧气分子转化成负离子状态，部分在分解酶的作用下形成氢氧根离子，形成大量的ROS。过量的ROS可攻击DNA、蛋白质和磷脂双键等重要的细胞组分，引起基因突变、蛋白变性、膜损伤等一系列事件发生，此外，还可诱发炎症和凋亡的重要信号启动，最终导致细胞凋亡和坏死。同时ROS 诱使血管内皮细胞、神经胶质细胞和神经细胞释放基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)，进一步损伤BBB，从而改变脑组织神经细胞的生理环境，加重神经炎症反应和脑水肿。BBB的损伤可间接引起钙超载，进一步加重脑组织损伤[21]。此外，体内激活的中性粒细胞可合成并释放大量的ROS，参与脑缺血再灌注损伤过程[22]。

热休克蛋白(heat shock protein，Hsp)是Ritossa最先在果蝇唾液腺中发现具有遗传高度保守的热应激蛋白质，又称应激蛋白。其分布广泛，存在于多种生物细胞当中。有研究表明当遭受缺血、氧化应激等应激时，Hsp在蛋白质内稳态、凋亡、细胞信号转导中均扮演着极其重要的角色[23]。基于氨基酸序列和分子量大小，Hsp可分为5个家族：(1)高分子量100～110 kD家族；(2)83～90 kD家族；(3)Hsp70家族：66～78 kD；(4)Hsp60家族；(5)sHsp家族：15～30 kD。Hsp27属于sHsp家族的重要一员，分子量约为27 kD。其C末端包含一个高度保守的α晶体蛋白结构域，而N末端包含保守程度较弱WDPF结构域。正常生理状态下，其在细胞的分化和发育中扮演着重要的角色；当受到外界不良刺激时，诱使Hsp27大量表达，可保护细胞免受外界不良刺激的损害。已有研究证据表明，在多种神经疾病模型中，Hsp27可明显减少神经细胞的损伤，在神经保护中起着重要的作用。Hsp27模拟肽(HSP27MP)是一种结构和功能与Hsp27类似的人工合成多肽。其氨基酸序列(专利原因暂未公开)可与凋亡信号调节激酶 I(ASK1)有效物理结合，抑制下游通路。吴庆建等[24]研究表明，HSP27MP可显著升高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽和过氧化氢酶的活性，抑制ROS的产生，进而改善缺血性脑梗死损伤。脂联素(adiponectin，APN)是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性糖蛋白。其由244个氨基酸所组成，单聚体分子量为30 kD。在结构上，APN由22个胶原重复序列的柄和高度保守的球状结构域所组成。正常机体的血浆中APN含量丰富，具有多种生物学功能，如具有降血脂、降血糖、胰岛素增敏等作用。有相关研究[25]证实，APN通过抑制氧化应激损伤，从而发挥相应的保护作用，而同时亦有研究[26]证明，机体脂联素的分泌不足与脑缺血损伤的严重程度成正比。脂联素多肽是根据脂联素氨基酸序列，采用蛋白质分析技术和多肽合成技术得到的一种多肽，岳亮等[27]研究表明脂联素多肽通过激活 SIRT1/PGC-1α通路抑制谷氨酸盐诱导氧化应激损伤以及减轻神经细胞的凋亡。

2.2 炎症与多肽类药物

炎症在IS的病程进展中发挥着重要的作用。脑缺血可引起促炎和抗炎反应之间的失衡，即促炎反应大于抗炎反应，从而引发脑组织的一系列的炎症反应。然而，炎症标志物的水平与IS患者的预后密切相关。IS的炎症反应是一个动态过程，缺血损伤的初始炎症应答常由小胶质细胞和白细胞所诱导。随着病程的进展，缺血中心区的坏死组织释放大量的炎症介质，进一步激活免疫应答，从而促进更多炎症介质的释放，如TNF-α、IL-1β、IL-8等，加重整个炎症进程。然而，适度的炎症反应可维持机体内环境的稳定。在正常情况下，当机体遭受缺血、炎症和神经变性的不良情况时，小胶质细胞下发挥其免疫巨噬细胞样的“清道夫”功能，清除受损组织以及ROS、RNS等，维持炎症动态平衡以及脑内微环境稳定[28]。随着缺血进展继续发展，一般在脑缺血后的几分钟内，迅速激活的小胶质细胞转化为吞噬细胞，并且释放多种炎症介质[29]，增加BBB的通透性，诱使脑水肿和组织坏死的发生[30]。同时，缺血区域的星形胶质细胞也被激活并释放ROS和炎症介质，诱导脑内皮上黏附分子的表达并促进中性粒细胞的脑内迁移，从而激活炎症反应。中性粒细胞一般在脑缺血损伤30 min至数小时内进入脑实质，24～48 h浸润达到高峰[31]。中性粒细胞通过释放大量的促炎介质，导致神经性炎症以及神经损伤。由上可见，炎症的发病机制涉及多方面，多层次，相当复杂，其具体机制目前尚并未完全阐明。

c-rel是核因子κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)家族重要成员之一，大鼠脑缺血再灌注可上调c-rel蛋白表达，其过度活化会加重免疫炎症反应程度。而IκappaB激酶(IκappaB kinase，IKK) -NEMO绑定区域(NEMO binding domain，NBD) 多肽是一种渗透性较强的NF-κB特异性抑制剂，它可阻止IKK降解IκappaB(IκB)，从而抑制NF-κB入核。Desai等[32]研究发现侧脑室注射IKK-NBD多肽可明显降低炎症反应对BBB的损伤，对大鼠局灶性脑缺血具有较好的神经保护作用，其作用机制与减轻缺血后炎症反应和减少DNA内的基因断裂有关。此外，李扬等[33]研究证实IKK-NBD多肽可以减轻局灶脑缺血再灌注后的炎症损伤，其作用机制与上调IκBα 限制c-rel入核，下调IL-1β，上调IL-10有关。NBD多肽是一种由6个氨基酸残基组成并可特异性抑制NF-κB的小分子肽，其与IKK的调节亚基 NEMO 结合从而阻碍NEMO与IKK 复合物催化亚基(IKKa/IKKβ)的 NBD位点结合，影响IKK复合物之间的相互作用，阻止 IKK激活，从而选择性地抑制NF-κB的过度激活，有效调节由 NF-κB所诱导的炎症免疫反应[34]。秦文熠等[35]研究表明NBD多肽可有效降低促炎因子水平，减轻神经细胞受损，抑制海马区内炎症反应，有效缓解脑缺血再灌注损伤。

2.3 细胞凋亡与多肽类药物

在IS的病程进展过程中，其中一个关键环节是细胞凋亡。降低缺血早期的细胞凋亡对改善轻度的缺血性脑损伤具有重要的意义。在缺血数小时后，细胞凋亡可见于半暗带区。而神经细胞的凋亡主要是由B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)家族基因和半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族基因参与并以线粒体为中心的凋亡过程。作为Bcl-2家族的Bcl-2和Bax是细胞凋亡的两个经典标志物。其中Bcl-2具有抑制凋亡的作用，而Bax具有促进凋亡的作用，两者在细胞凋亡进程中发挥着重要的调节作用[36]。脑组织缺血损伤可降低Bcl-2的表达，增加Bax的表达，进一步激活半胱天冬酶，引发依赖性细胞凋亡的级联反应。Caspase家族参与了线粒体依赖性途径和非依赖性途径。活化的半胱天冬酶，如Caspase-1 和Caspase-3主要在缺血介导的细胞凋亡早期起着关键作用，而其他半胱氨酸蛋白酶家族成员，如Caspase-2和Caspase-8，则可能在凋亡晚期起着重要作用。此外，在缺血性脑损伤期间兴奋性毒性、钙超载、氧化损伤、炎症均会导致细胞凋亡，这些发病机制并非独立存在，而是互相影响，互相促进。

扇贝多肽是利用现代海洋生物工程技术从栉孔扇贝中提取的水溶性小分子多肽，氨基酸序列为Pro-Asn-Thr-Hyl-Ser-Cys-Arg-Cly，相对分子质量为879，现代物理学研究[37]表明其具有抗细胞凋亡、增强机体免疫功能、抗氧化等多种药理作用。吴青等[38]研究发现扇贝多肽可显著增强缺血海马神经元的活性，降低凋亡率。Humanin(HN)是由Hashimoto于2001年在阿尔茨海默病(Alzheimer’S disease，AD)患者大脑枕叶皮层未受损脑区发现的一段新基因，可编码由24个氨基酸组成的多肽，简称HN多肽，氨基酸序列为Met-Ala-Pro-Arg-Gly-Phe-Ser-Cys-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Ser-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Ala。高广生等[39]研究发现HN多肽通过激活STAT3上调抗凋亡MCL-1的转录，增加SOCS3的表达，降低凋亡标志性蛋白Bax、Caspase-3的表达，从而减少神经细胞凋亡。

2.4 自噬与多肽类药物

自噬(autophagy)是细胞在溶酶体介导下通过降解细胞质中受损的生物大分子、细胞器或病原微生物，以维持细胞稳态的正常降解途径，其具有高度保守性[40]。自噬具有多种生理和病理作用，生理状态下，神经系统中适度的自噬反应被认为具有神经保护作用。如在缺血、缺氧等外界条件刺激下，自噬可通过降解细胞内受损的细胞器及异常生物大分子为细胞提供能量。自噬过程中，细胞质中待降解成分包被进去双膜囊泡而形成自噬体，并与溶酶体融合形成单膜的自噬溶酶体，最后包被物被溶酶体水解酶所降解[41]。其中beclin-1和LC3是自噬反应中的两种标志性蛋白，Bcl-2/beclin-1复合物被认为是调节自噬体膜形成的分子开关[42]，而LC3的胞浆型LC3( LC3-Ⅰ)和膜型LC3( LC3-Ⅱ)的转化率可反映自噬水平的高低。然而，过度自噬是一种病态的生理过程，可降解细胞核导致细胞的死亡[43]。近年来研究[44]表明自噬在IS的发病机制中占着重要的地位。

细胞穿透肽(cell-penetrating peptides，CPPs)是一类对细胞膜具有强力穿透作用的短肽，某些CPPs甚至可以穿透BBB发挥其药理作用，已有研究表明其对多种神经退行性疾病具有神经保护作用[45]。CPPs主要由5～30个氨基酸所组成，其细胞毒性较低，对机体不产生免疫反应。R18属于CPPs的一种多肽，研究发现R18多肽可通过抑制细胞自噬保护大鼠颅脑创伤所引起的神经细胞损伤以及谷氨酸诱导的神经细胞损伤[46]，也可促进神经元的细胞活性以及抑制自噬所引起神经元损伤[47]。

3 展望

多肽类药物作为生物医药中的重要一员，以其生物活性高、靶向专一性高、选择性高、毒副作用低等优越的药用特点，具有广阔的临床应用前景。一系列的多肽已对IS的防治展现出理想的效果，如HSP27MP、IKK-NBD多肽、HN多肽等，它们具体作用机制涉及氧化损伤、炎症、凋亡和自噬等。相信随着IS机制的深入认识以及各类多肽类药物的不断开发，高效、安全的抗IS多肽类药物在未来将会广泛用于临床并造福患者。