结核疫苗的研究现状与进展

曹颖 综述 张湘燕△ 张翊玲 审校

(1.贵州医科大学研究生院，贵州 贵阳 550004；2.贵州省人民医院呼吸内科，贵州 贵阳 550004)

近年来，结核病成为传染病中的“头号杀手”，虽然结核病的诊疗不断标准化，但是全球结核病的控制情况仍不容乐观。如果在早期病程中应用合理的干预措施，可能会得到有效控制，为此就目前结核疫苗研究进展及现状作一综述。

1 研究背景及现状

1.1研究背景 近年来，结核病已成为传染病“头号杀手”。据WHO统计，全球已有近1/3人口约20亿人感染结核分支杆菌，结核病患者达到2 000万名[1]。95%的结核感染被认为是以无症状的潜伏形式存在[2]。肺结核常发生在贫穷、边缘和社会地位低下群体和社区，包括营养不良、免疫力低下、流离失所、监禁、肠道寄生虫普遍感染的地方和特定少数民族的人群[1-2]。虽然大部分感染者体内结核杆菌都处于抑制状态，但还是有大约10%的几率会“苏醒”过来，造成各种结核病变[1]。目前使用最广泛的结核疫苗被称为卡介苗(BCG)，于1921年开发，在结核病高发国家被常规用于婴幼儿、儿童急性粟粒性肺结核与结核性脑膜炎等严重疾病的预防。应用至今已有90多年，为结核分枝杆菌的“近亲”—牛型结核分枝杆菌(M.bovis)进行多次传代培养，得到了减毒的活性结核分枝杆菌疫苗—卡介苗[3-4]。这款疫苗为全球应用最广泛、使用最多的结核疫苗，虽然新生儿接种卡介苗效果肯定，但对多数成人肺部疾病的预防作用不一，有的几乎无效，防治效果差异显著。虽然卡介苗能预防原发性结核病，但对已感染结核分枝杆菌却束手无策。全球已采取综合措施有效的控制90%结核分枝杆菌感染人群，但其中10%仍将发展成为活动性疾病，给全球带来了严重的疾病压力及巨大医疗和经济挑战[5-6]。

1.2正确评价和认识卡介苗的免疫保护力 卡介苗本身为牛型结核分枝杆菌减毒株，其免疫效果一方面受环境分枝杆菌的影响，一方面经反复传代培养和保存导致保护性抗原不同程度丢失，与HRv株比较，在传代培养过程中，丢失了大量的抗原基因即缺失16个区域( RD1～RD16)，共包括129个开放阅读框[7]。RD1区在所有的卡介苗中都缺失；其中RD3～RD7、RD9～RD13区域在牛分枝杆菌中发生缺失；RD2、RD8、RD14、RD15、RD16区域在不同子代卡介苗出现缺失。RD1区9个基因全部丢失，基因包括Rv3871～Rv3879。在形成卡介苗的毒力衰减过程中，基因缺失是重要原因之一[7]。ESAT6、CFP10是RD1区核心的T细胞抗原，能诱导产生免疫应答。有研究[8]表明敲除RD1基因，可以降低结核分枝杆菌的毒力。目前研究最多的为RD1区基因编码的ESAT-6[9]，能诱导强烈的T细胞免疫反应，检测ESAT-6抗原特异性反应也是一个非常有价值的诊断方法，它是一种分泌型蛋白，其功能未知，由于BCG缺失ESAT-6，可利用此种抗原来鉴别为卡介苗接种还是结核分支杆菌感染。由于ESAT-6特异性反应强，可用于鉴别结核是否处于结核早期(感染早期)还是潜伏期或亚临床期[9]。由于环境因素与卡介苗传代等因素影响，卡介苗菌株的遗传特性发生变化，导致卡介苗本身的不足与局限性。正确认识卡介苗的遗传特性，对研究新型结核疫苗具有指导意义。

1.3结核耐药情况 本世纪初以来，由于卡介苗的广泛应用及各种抗结核药物的问世，抗结核治疗取得了突破性进展。然而，多重耐药结核杆菌(MDR-TB)、广泛耐药结核杆菌(XDR-TB)以及完全耐药结核杆菌(TDR)的出现，对全球结核病的控制带来了新的挑战与威胁。耐药结核病发生与大多数结核病流行国家药敏试验的实验室设施不足相关，而实际的全球耐药结核病例数尚待估计[4]。在2008年大约44万例多重耐药结核发生，只有7%的人被鉴定并报告给世界卫生组织。这些病例中，只有五分之一是按WHO标准治疗[1]。MDR和XDR结核的治疗可以采用现有的诊断技术和药物，但疗程大大延长，同时费用更加昂贵及治疗难度增加，对于很多发展中国家的患者是难以承受的，长疗程用药其依从性也存在困难。随着结核杆菌耐药性的增加抗结核治疗的难度越来越大，严重威胁着人类健康。在结核耐药方面需进一步加强研究与探索，以寻求突破。

1.4结核分枝杆菌感染不同生长阶段表达不同的抗原 结核分枝杆菌感染的不同时期如早期、晚期、潜伏期，因生长阶段不同所表达的抗原也是不同的，而卡介苗在不断地传代过程中存在缺陷所以导致相关的生长阶段缺乏相应的保护性抗原编码的基因，所以不能产生免疫保护作用(相应的免疫保护作用)[10]。如今潜伏期感染的结核是全球抗结核治疗最大的挑战，治疗潜伏性结核感染(LTBI)需要很长化疗周期(9个月)，使治疗依从性极困难。有研究[11]表明联合使用早期抗原与晚期/潜伏期抗原可大大提高疫苗的免疫原性，引起很好的免疫保护，类似的很多研究均支持这一结论。南非的L.Govender等[12]研究与肺结核疾病比较，人类在潜伏感染中结核潜伏相关抗原Rv 2660和Rv 2659对CD4+ T细胞的反应更强。T.Stephen等[13]研究重组的卡介苗表达抗原Rv2659c、Rv3407和Rv1733c能协同提高老鼠模型的脾肺远期疗效，所得的数据表明重组卡介苗所表达的结核分枝杆菌潜伏相关抗原能提高对结核分枝杆菌免疫力与保护性。R.Virginie等[14]研究了结核分枝杆菌DNA疫苗及被结核感染的小鼠其八种休眠调节编码蛋白的免疫原性，包括Rv1733c、Rv1738、Rv2029c(pfkB)、Rv2031c/hspX(acr)、Rv2032(acg)、Rv2626c、Rv2627c与Rv2628，这些抗原除了Rv1738外均能引起较强的体液和/或细胞Th1型(IL-2和IFN-γ)免疫反应。D.Goletti等[15]研究的潜伏期抗原Rv2628与治愈的肺结核及远期感染相关，在远期感染中Rv2628反应是近期感染的5倍。由于卡介苗由于在传代培养过程中，使其丢失了大量的基因，因此存在很大的免疫缺陷。结核分枝杆菌感染不同生长阶段其编码不同时期抗原的基因及其重要，能对机体产生免疫保护作用。

2 目前候选疫苗的免疫机制(结核杆菌感染机体的免疫机制及保护性细胞因子分析)

目前的候选疫苗尤为关键的免疫机制是引起Th1细胞的刺激从而激活巨噬细胞的抗分枝杆菌能力，记忆性T细胞产生多种细胞因子参与免疫反应。不同的T细胞群参与结核病的免疫反应。至关重要的是CD4 T细胞产生1型细胞因子，特别是IFN- γ，与肿瘤肿瘤坏死因子(TNF)[16]。这些1型辅助性T细胞(Th1细胞)激活巨噬细胞，抑制细胞内的结核分枝杆菌的。因此，它是结核病的最为重要的免疫保护方式[17]。CD4 T细胞被组织相容性复合体(MHC)Ⅱ类基因产物—抗原肽刺激，结核分枝杆菌优先定植在自噬体里有利于主要组织相容性复合体MHC II类处理。CD8+T淋巴细胞产生的细胞毒性分子，如穿孔素，颗粒溶素和颗粒酶，它们不仅能裂解宿主细胞，而且也直接杀死结核分枝杆菌。Th17细胞可能在结核杆菌在早期阶段为单核细胞和Th1淋巴细胞进入并形成肉芽肿奠定免疫保护的基础。然而过度的Th17细胞刺激，会导致中性粒细胞和炎症细胞的过度表达引起损害。有证据显示[18]Th2细胞在结核分枝杆菌感染后，产生IL-4和IL-5，这些细胞因子能刺激B淋巴细胞产生抗体，由于Th2细胞能反调节Th1细胞，它们可能会损害抗结核的免疫保护。调节性T细胞(Treg)主要的生物学功能是控制或抑制免疫反应。Treg的活化会导致过早的免疫抑制，Treg和其他免疫调节方式一样如T细胞耗竭，将有助于肺结核疾病的复发与激活。在慢性感染性疾病中，Treg抑制炎症反应限制组织损伤，可以利用Treg的诱导活性作为疫苗免疫的最佳诱导效应[19]。目前的候选疫苗仅能减少初始细菌感染，不能消灭病原体，仅能预防疾病。事实上，疫苗免疫(免疫反应)应该包含肺结核从增生活跃到停止与休眠的各个阶段。因此未来的疫苗接种策略应将加大免疫学方面的探讨与认识。

3 结核疫苗研究情况

10年前，只有为数不多的几个结核疫苗产品在开发，现在已经有十几个了，由于卡介苗自身存在缺陷与不足，对成人预防效果不一[1]。但该疫苗应用90余年，对婴幼儿的结核防治作用肯定。新疫苗的疗效评价需要仔细的分析和试验来尽可能地检测其安全性[4]。一般而言，第一代候选疫苗大致可以分为两种，第一种是指可以完全取代卡介苗；第二种是提高卡介苗保护效果的加强剂。与此同时，科学家们正致力于一种治疗型疫苗研究，就是通过激活人体免疫系统，清除体内潜伏感染的结核杆菌[9-11]。肝素结合血凝素(HBHA)是一个有趣又有挑战性的候选疫苗，疫苗的保护价值在于对潜伏感染病人具有免疫原性。HBHA疫苗刺激卡介苗诱导的保护作用。因为蛋白质是高度甲基化，这种结构使得它很难在一个不相关的表达系统产生蛋白质的重组。我们常指的是预防性疫苗，主要针对于预防。而治疗性疫苗主要指疾病的治疗。现今研究的疫苗大多集中在治疗性疫苗，但主要局限于小鼠研究。根据结核病疫苗的种类可以分为全菌疫苗(包括减毒活疫苗和全菌失活疫苗等) 和亚单位疫苗( 包括蛋白质/多肽、DNA疫苗、以病毒为载体的重组疫苗等)；但目前尚无一种候选疫苗的保护性和持续性优于卡介苗[1-4]。随着相关疫苗的进一步理解与深入，每种疫苗都各有特点与优势，同时又存在一定的缺陷与不足。

4 新型TB疫苗的研发现状

4.1亚单位疫苗 由一种或多种MTB蛋白组分与免疫佐剂联合应用而成的疫苗。亚单位疫苗是将致病菌主要的保护性免疫原存在的组分制成的疫苗。此类疫苗能通过一种或者几种保护性抗原刺激产生有效的免疫反应。该疫苗具有以下特点：安全性高；纯度高，稳定性好；产量高；用于有免疫病理作用的，或病原体难于培养疫苗研究[1-5,20]。亚单位疫苗易于被人们接受，不过需要对免疫佐剂做更深入的探索研究。使用蛋白质多肽疫苗主要考虑抗原的选择和佐剂的应用，将多个抗原融合表达，有助于提高疫苗的免疫保护效率。

4.2佐剂 使用蛋白质/多肽疫苗主要考虑抗原的选择和佐剂的应用，只有有效的佐剂辅助才能产生理想的免疫应答。不同的免疫佐剂可以引起Thl或Th2型不同的免疫反应[20]。亚单位疫苗易于被人们接受，不过需要对免疫佐剂做更深入的探索研究，避免终生应用佐剂来保持亚单位疫苗的免疫性。

4.3重组卡介苗疫苗 卡介苗是牛型结核分枝杆菌的减毒株，与人型致病的结核分枝杆菌基因组比较，缺失129个编码基因，重组卡介苗是对卡介苗本身进行改造，弥补卡介苗的缺陷，使其能够表达MTB的某些重要抗原来增强卡介苗的免疫原性[19]。此外，在卡介苗中重组表达干扰素和IL-12等细胞因子，可以增强卡介苗诱导细胞免疫反应的能力，促进免疫反应向Thl型转化，具有重要的免疫调节作用[21]。虽然rBCG30保护力超过其它的候选疫苗，但是否存在其它影响该疫苗免疫保护的未知因素我们还不得而知，需继续加以观察与研究；其生物安全性仍需进一步分析与深入研究[22]。

4.4重组活载体疫苗 重组活载体疫苗应用无病原性或弱毒疫苗株细菌和病毒，例如卡介苗分枝杆菌和沙门氏菌弱毒疫苗株、痘病毒等作为载体，插入外源性保护基因，构建重组活载体疫苗[23]。首先要确保作为载体的微生物对机体是安全的，同时要求各成分之间一般不发生相互干扰或排拆现象，并在体内持续表达结核特异性抗原，载体本身具有佐剂的作用，因此产生强烈的T细胞免疫反应，免疫保护效果更强，该类疫苗常应用于加强免疫中，其开发和应用前景较好[24]。重组活疫苗利用安全的微生物将抗原送入体内发挥相应的作用，载体本身就具有免疫佐剂的作用等优势，值得我们进一步深入研究与探讨。

4.5DNA疫苗 DNA疫苗，又称“裸”DNA疫苗、基因疫苗，核酸疫苗等相关名称。DNA疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因重组于真核表达元件，构成重组质粒DNA，通过各种方法将质粒导入机体，使外源基因在活体内表达，产生免疫反应[25]。DNA疫苗具有以下优点：DNA导入的载体(如质粒)其结构简单，生产成本较低；DNA疫苗制作与更新方便容易；外源基因在体内能够持续刺激产生持久的免疫应答；不同抗原基因的质粒可以同时联合免疫；可以混合多种生化特性类似的质粒DNA；DNA疫苗不用加佐剂，成本低；基因疫苗在接种后，可以诱导产生细胞和体液免疫；DNA分子很稳定；毒性逆转的可能性不大；质粒载体可以反复使用[26]。然而DNA疫苗尚未得到广泛的应用，因为DNA疫苗涉及到如何应用抗原、佐剂、及DNA本身的生物安全性等问题，而安全问题则是人们对它的最大顾虑。结核病DNA疫苗既能成为预防性疫苗，还可以成为治疗性疫苗。DNA疫苗的优点多于其他一切疫苗。但DNA疫苗最大缺陷就是对较大哺乳动物缺乏免疫原性[25]，因此，如何提高DNA疫苗的免疫效力仍需要继续研究与进一步探讨。

5 当前困境与展望

虽然随着WHO推荐的肺结核诊断和治疗的标准化的方法广泛应用，在1995和2008之间超过3600万人被治愈的，避免了600万人死亡，然而全球结核病控制是远远没有完成。结核病仍然严重威胁全球公共健康，几个关键的挑战依然存在，如技术诊断、治疗落后和不充分的预防[1-6]。多重耐药(MDR)结核病仍是一个严重的威胁。庆幸的是，现有的药物疗法可以治愈大多数的患者，如果在早期病程中应用合理的干预措施，可有效降低传播率、防止疾病蔓延[1-4,20]。加强结核病例发现，感染控制，和异烟肼预防性治疗联合对艾滋病毒相关的结核病防治，通过个体的免疫重建和降低HIV的传播引起结核病发病率短期和长期的下降[5,26]。虽然2050年消除肺结核作为一个全球性公共健康问题的长期远大目标，只有通过新的干预措施和发展新型疫苗，才可以实现这一重大贡献。