不同营养程度湖泊中细菌群落组成及其分子生态网络特征

陈光哲, 姜星宇, 胡 洋

1.江苏省农业科学院, 江苏 南京 210008 2.中国科学院南京地理与湖泊研究所, 江苏 南京 210008 3.中国科学院大学, 北京 100049

湖泊是水生态系统的重要类型之一，其内部生物群落与生态环境之间相互依存、相互影响，从而驱动着大量生物活性元素的地球化学循环过程[1]. 作为湖泊生态系统中的重要组成部分，细菌在物质循环和能量流动等生态过程中具有举足轻重的作用. 因此，深入了解湖泊生态系统中细菌群落组成、多样性及其分布特征是系统地理解湖泊生态系统结构和功能的基础和前提.

作为湖泊生态系统食物网的主要分解者，水体中常见的细菌类型已经基本确定，包括α-、β-、γ-变形菌(Proteobacteria)、拟杆菌(Bacteroidetes)、疣微菌(Verrucomicrobia)及放线菌(Actinobacteria)等[2]. 它们将大量有机物分解和利用，继而同化成为自身的组成物质，最终再被浮游动物捕食，该过程被称之为微食物环[3-5]. 同时，细菌还是湖泊生态系统中重要的生产者. 如在一些咸水湖泊中，化能自养细菌以硫化物为电子受体，是湖泊生态系统中初级生产力的主要贡献者[6].

然而，随着社会和经济的飞速发展，大量营养物质直接或间接地排入湖泊生态系统中，使得这些长江中下游区域湖泊大多处于不同程度的富营养状态[7-9]. 不同营养程度湖泊的水环境是决定细菌群落组成和结构的主要因子[10-11]. 在众多湖泊水体中，磷是影响细菌群落分布的关键环境因子[12-13]. 而在水库水体中，氮则是细菌群落变化的决定因子[14]. 除此之外，pH、水温及ρ(Chla)等都是影响细菌群落变化的重要因子[15-16]. 总的来说，中度营养状态会显著地增加细菌数量、生物量及生长速率[17]，同时还会提高细菌群落的生物多样性；相反，重度富营养化所带来的环境胁迫使得其多样性下降[18]，造成细菌群落资源利用方式单一，严重影响湖泊生态系统的物质循环和能量流动.

值得注意的是，上述关于湖泊水体中细菌群落的研究多是采用分子指纹图谱[19]、荧光杂交[20]及分子克隆文库[21]等技术. 虽然这些研究手段使得微生物学家开始对那些难以在实验室生长的微生物展开深入研究，但其结果往往只能反映出样品中少数优势种的信息，使得细菌群落中大量稀有种被严重忽视[22]. 近年来，伴随着基因测序技术的快速发展，细菌群落中稀有种的重要作用已经得到了广泛认识[23-24]. 然而，飞速发展的测序技术为微生物学提供了新的研究方向，同时也带来了新的困难. 如何科学地解译、分析高通量测序所产生的大量数据是目前微生物学发展的难题之一. 之前大多数研究均是简单地提取高通量数据、探究细菌群落的组成、多样性特征及其与环境因素相互关系[25-27]. 事实上，在复杂的细菌群落中，各物种之间存在着一系列的相互作用，如竞争、合作、共生等[28]. 但是由于缺乏相应的数据挖掘方法，使得这方面的研究十分薄弱. 基于描绘和表征微生物群落内部物种相互关系的分子生态网络，为理解复杂微生物之间的潜在相互作用提供了一种可靠的方法[29]. 研究表明，生态网络分析能够准确发掘各微生物间的相互关系及其与周围环境的密切关系[30-31]，同时还能确定群落中的“关键物种”[32]. 该方法已经广泛应用于农田、湿地、海洋以及牲畜养殖等微生物生态学方面的研究中[33-34].

因此，为了比较中度富营养湖泊和重度富营养湖泊中细菌群落的差异，该研究选取了长江中下游区域的10个湖泊作为研究对象，通过高通量测序技术分析了不同营养程度湖泊中细菌群落的组成，并通过构建其分子生态网络，探讨其影响机制，以期为富营养化湖泊的治理和修复提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 样品的采集

样品的采集于2014年7月19日—23日进行. 在江苏省和安徽省选取10个典型的营养水平不同的湖泊(升金湖、大官湖、泊湖、麻塘湖、太平湖、白荡湖、西巢湖、东巢湖、枫沙湖、梅梁湾、竺山湾、破罡湖)，共12个采样点(见图1),均位于湖泊的湖心区，利用2.5 L便携式采水器收集表层50 cm处湖水样品，冷藏保存后带回实验室进行分析.

图1 研究区采样点分布Fig.1 The map of sampling sites in this study

水温(WT)、pH及ρ(DO)等采用多功能水质分析仪(YSI, 6600V2, USA)原位测定；ρ(TN)、ρ(TP)、ρ(NO3--N)、ρ(NH4+-N)、ρ(DOC)(DOC表示溶解性有机碳)、ρ(TSS)(TSS表示总悬浮物)及ρ(CODMn)根据《水和废水监测分析方法》的标准方法测定[35]；ρ(Chla)先用二甲基甲酰胺萃取，然后在647和665 nm处测定吸光值，最后根据[Chla]=12.70A665 nm-2.79A647 nm计算ρ(Chla)[36].

1.2 细菌DNA提取及16S rRNA Illumina高通量测序

在过滤水体中细菌群落之前，先用200目(1目=1.5 μm)的尼龙网将水体中大颗粒杂质去掉. 然后，将过滤后的水样置于0.22 μm的聚碳酸酯膜(Millipore Boston, MA, USA)上以真空泵负压抽滤. 滤膜用无菌剪刀剪碎后用FastDNA Spin Kit for soil试剂盒(美国MPbio公司)提取总DNA. 利用NanoDrop ND-1000分光光度计(美国NanoDrap Technologies公司)测定DNA浓度，纯化后将DNA样品保存于-80 ℃超低温冰箱，直至进行Illumina测序.

将提取好的DNA样品利用16S rDNA V4可变区扩增引物进行PCR扩增，前向引物序列为515F(5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′)，反向引物序列为806R(3′-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-5′). PCR反应条件为30个循环，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸10 min. PCR产物经凝胶电泳检测扩增出预期大小的片段且没有非特异性条带后，用PCR片段纯化试剂盒纯化. 将纯化后的PCR产物送至上海美吉生物医药科技有限公司的Miseq平台进行双末端测序(美国Illumina公司).

下机后的数据用Qiime流程分析[37]，去除连续3个以上且质控得分小于20的碱基，同时保留长度大于250 bp的序列，然后，利用UCHIME去掉嵌合体[38]，使用UPARSE将具有≥97%相似性的序列聚类为一个OTU(operational taxonomic unit, 分类操作单元)[39]，选择其中最长的序列作为代表序列，并使用RDP分类器根据SILVA数据库比对，获取OTU的物种分类学信息[40]. 另外，将相对丰度大于1%的物种定义为丰富种，小于1%的物种定义为稀有种.

1.3 网络构建

在Cytoscape 3.5.1中利用CoNet插件，选择出现频率大于80%的OTUs作为构建分子生态网络的节点. 根据相似性(斯皮尔曼系数和皮尔森系数)和距离矩阵(Bray-Curtis距离和Kullback-Leibler距离)，通过模型自动设定合适的阈值导出邻接矩阵，用邻接矩阵来编码每对节点之间的连接关系，对每一条边进行100次的Permutation和Bootstrap显著性检验.

1.4 数据分析

该研究所有数据分析与可视化均使用R语言(version 3.2.3)中的vegan和ggplot 2程序包. 在计算多样性之前，首先根据各样点序列中的最小序列数进行重抽样. 利用diversity函数计算细菌群落中的Shannon-Wiener指数、Simpson指数和Ace指数. 利用T检验对中营养和富营养湖泊的水环境特征进行差异性分析. 利用相似性分析(analysis of similarities, ANOSIM)对中度富营养湖泊和重度富营养湖泊中的细菌群落进行显著性检验. 在进行冗余分析(redundancy analysis, RDA)前，对细菌群落数据进行Hellinger转化，以消除大量稀有种的影响，并利用envfit函数对环境因子进行显著性检验. 利用非度量多维标度法(nonmetric multidimensional scaling, NMDS)对细菌群落进行排序. 利用Mantel检验分析细菌群落与地理距离之间的关系. 利用STAMP分析对细菌群落物种组成进行差异性分析. 湖泊综合营养状态指数(TLI)及评价标准参考文献[41].

2 结果与分析

2.1 湖泊水体理化特征

选取Chla、TP、TN、SD以及CODMn五项参数，计算湖泊综合营养状态指数. 其中，升金湖、大官湖、泊湖、麻塘湖、太平湖及白荡湖的TLI分别为34.82、36.73、39.87、45.47、38.92和42.98，属于中度富营养湖泊；西巢湖、东巢湖、枫沙湖、梅梁湾、竺山湾和破罡湖的TLI分别为58.03、56.22、53.72、59.00、64.84和69.18，属于重度富营养湖泊.

图2 中度富营养湖泊和重度富营养湖泊水环境特征Fig.2 The environmental characteristics of the moderate and severe eutrophic lakes

中度富营养湖泊和重度富营养湖泊的水体理化特征如图2所示. 由图2可见：中度富营养湖泊和重度富营养湖泊水温均较高且无显著性差别(P>0.05)，分别为(30.78±1.47)和(32.73±3.00)℃；重度富营养湖泊中ρ(DO)略高于中度富营养湖泊，分别为(9.68±2.82)和(7.53±0.88)mgL，但二者之间也无显著性差异(P>0.05)；ρ(NH4+-N)和ρ(NO3--N)在这两种湖泊中也均无显著性差别(P>0.05)；中度富营养湖泊中ρ(TN)(0.70 mgL)远小于重度富营养湖泊(1.53 mgL)，前者甚至不足后者的一半，具有明显的差异(P<0.05)；ρ(TP)、ρ(Chla)、ρ(DOC)在中度富营养湖泊中分别为0.02、8.06和2.43 mgL，而在重度富营养湖泊中分别高达0.12、63.78和4.81 mgL，具有明显差异(P<0.05).

2.2 水体细菌群落多样性及其组成特征

中度富营养湖泊中细菌群落的 1 159 个OTUs分属于27个门、51个纲、86个目、156个科、181个属. 重度富营养湖泊中细菌群落的 1 314 个OTUs分属于32个门、64个纲、104个目、170个科、187个属. 这两种湖泊中细菌群落的Shannon-Wiener指数分别为4.04±0.14和3.80±0.42，Simpson指数分别为0.94±0.01和0.92±0.04，Ace指数分别为895.75±35.42和831.24±89.23.T检验结果表明：两种湖泊中细菌群落的α多样性无显著性差异(P>0.05)；但β多样性则具有明显的差异. 由图3可见，中度富营养湖泊和重度富营养湖泊中细菌群落分别位于第1象限和第3象限. 相似性分析结果表明，两种湖泊中细菌群落的差异性极为显著(R=0.23,P=0.04). 值得注意的是，丰富种的亚群落在这两种湖泊中并无差异(R=0.17，P=0.05)，但是稀有种亚群落则具有显著的差异(R=0.15，P=006).

图3 中度富营养和重度富营养湖泊中 细菌群落NMDS分析结果Fig.3 The non-metric multidimensional scaling analysis of the bacterial community in moderate and severe eutrophication lake

在中度富营养湖泊中，优势门类主要有放线菌(Actinobacteria，占比为43.80%)、变形菌(Proteobacteria，占比为22.01%)、蓝细菌(Cyanobacteria，占比为8.95%)、拟杆菌(Bacteroidetes，占比为8.94%)、疣微菌(Verrucomicrobia，占比为7.22%)、浮霉菌(Planctomycetes，占比为2.32%)及绿弯菌(Chloroflexi，占比为1.04%). 在重度富营养湖泊中，最优势门类也是放线菌(Actinobacteria，占比为40.82%)，其次为变形菌门(Proteobacteria，占比为22.66%)、拟杆菌门(Bacteroidetes，占比为14.97%)、疣微菌门(Verrucomicrobia，占比为6.19%)、绿弯菌门(Chloroflexi，占比为4.11%)、蓝细菌门(Cyanobacteria，占比为3.96%)和浮霉菌门(Planctomycetes，占比为2.69%).

图4 中度富营养和重度富营养湖泊中细菌群落的组成Fig.4 The bacterial community composition in mesotrophic and eutrophic lakes

中度富营养湖泊和重度富营养湖泊中细菌群落均有12个优势纲类〔见图4(a)〕，主要为放线菌纲(Actinobacteria，占比分别为23.33%和29.74%)、酸微菌纲(Acidimicrobiia，占比分别为19.74%和10.91%)、鞘脂单胞菌纲(Sphingobacteriia，占比分别为7.33%和12.74%)、β变形菌(Betaproteobacteria，占比分别为6.38%和13.33%)等. 通过组间差异分析(STAMP)表明，在这些优势纲类中，只有绿菌纲(Chlorobia)和β变形菌在中度富营养湖泊、重度富营养湖泊中细菌群落具有显著性差异(P<0.05)，分别为1.04%、4.11%和6.38%、13.33%，可见在重度富营养湖泊中其相对丰度均更高.

在属水平上，中度富营养湖泊和重度富营养湖泊中细菌群落均有10个共有优势属类〔见图4(b)〕，主要为Hgcl_clade(占比分别为20.78%和24.37%)和CL500-29_marine_group(占比分别为19.63%和10.10%). 组间差异分析结果表明，这些优势属类在两种湖泊中均无显著性差异(P>0.05).

2.3 细菌群落的影响因素

图5为在属水平上细菌群落与水环境特征的冗余分析排序. 冗余分析结果(见图5)显示，湖泊水环境因子共解释了细菌群落变异的48.51%，其中第1主轴和第2主轴分别解释了21.17%和16.99%.ρ(TN)、ρ(NH4+-N)及ρ(TSS)与细菌群落变异之间的关系极为显著(P<0.05). 除了环境因子，笔者还研究了细菌群落与地理距离之间的关系. Mantel检验结果表明，细菌群落与地理距离之间无显著性关系〔R=-0.08,P=0.59(>0.05)〕.

注：** 表示0.01的置信水平.图5 细菌群落与环境因子之间的冗余分析结果Fig.5 Redundancy analysis of bacterial community and aquatic environmental parameters

笔者对细菌群落的优势类群和环境因子进行了相关性分析(见表1). 由表1可见，细菌类群的优势类群与环境因子之间主要为正相关关系. 在纲水平上，Actinobacteria与ρ(NH4+-N)和ρ(TN)呈显著负相关、与ρ(NO3--N)和ρ(NH4+-N)呈显著正相关；Chlorobia与ρ(DOC)呈显著正相关；Verrucomicrobia与ρ(TSS)和ρ(TP) 呈显著正相关；Flavobacteriia与水温和ρ(NH4+-N)分别呈显著负相关和显著正相关. 在属水平上，Hgcl_clade与水温呈显著负相关，与ρ(NH4+-N)和ρ(NO3--N)呈显著正相关；Prochlorococcus与ρ(TN)呈显著正相关；Methylacidiphilum与ρ(TSS)和ρ(TSS)均呈显著正相关.

2.4 细菌群落分子生态网络特征

该研究构建了中度富营养湖泊和重度富营养湖泊中细菌群落的分子生态网络(见图6). 由图6可见：中度富营养湖泊中细菌生态网络要比重度富营养湖泊小，前者的网络节点和边数量分别为109和183，后者则分别为119和227. 值得注意的是：在前者网络中，92.90%的边为正相关关系，在后者网络中，仅74.44%的边为正相关关系. 作为代表网络紧密关系程度的中心性参数，中度富营养湖泊中细菌群落网络显著大于重度富营养湖泊(P<0.05)，前者的接近中心性和中介中心性分别为 0.000 9 和276.23，后者则分别为 0.000 2 和158.34. 根据贪婪算法，中度富营养湖泊中细菌网络可被分解为9个模块，而重度富营养湖泊中细菌网络则可被分解为12个模块.

表1 中度富营养湖泊水体中细菌群落优势类群与环境因子的相关性分析

注： *表示0.05的置信水平；** 表示0.01的置信水平； *** 表示0.001的置信水平. 数字加粗表示显著相关.

图6 中度富营养和重度富营养湖泊中细菌群落分子生态网络Fig.6 Molecular ecological network of bacterial community in mesotrophic and eutrophic lakes

除此之外，中度富营养湖泊中细菌生态网络的平均聚集系数也小于重度富营养湖泊，分别为0.34和0.45.

3 讨论

随着社会和经济的快速发展，我国越来越多的湖泊已进入富营养化状态. 根据湖泊综合营养状态指数，该研究中的10个湖泊可以分为中度富营养湖泊和重度富营养湖泊两种，前者水体中的活性元素(主要为氮、磷和碳)的质量浓度均显著低于后者. 因此，作为对外界环境变化极为敏感的有机体，这两种类型湖泊中细菌群落的组成也具有显著性差异. 这与前人的研究[18]也基本保持一致，如富营养化湖泊与贫营养水库中的细菌群落差异十分明显[42]. 即使在同一湖泊中，不同营养水平湖区水体中的细菌群落组成和结构也具有显著的差异[18]. 正如物种筛选过程[43,44]所述，细菌群落组成的分布特征主要是由环境的异质性决定的. 冗余分析的结果也直接证明了这一点，即细菌群落与氮素质量浓度〔包括ρ(NH4+-N)和ρ(TN)〕和ρ(TSS)之间关系极为显著，而与地理距离之间则无明显关系. 通过相关分析表明，细菌群落中的优势类群与环境因子之间主要为正相关关系，这说明随着水体中营养盐浓度的增加更有利于细菌群落中优势种类的生长和繁殖.

在这两种类型湖泊中，Actinobacteria均为第一优势类群，该生物类群也是各种水环境细菌群落中的优势门类，包括湿地、湖泊及海洋等[45-47]. 可能原因是：①相比其他细菌门类而言，放线菌能够更好地躲避原生动物的捕食，导致其死亡率相对较低[48-49]；②在氮、磷元素充足的湖泊中，碳源常常成为细菌生长繁殖的制约因素. 放线菌在利用碳源，尤其是浮游植物分泌的溶解性有机碳时具有更强的竞争力[50]. 在属水平上，Hgcl_clade和CL500-29_marine_group为优势类群. 研究[51-52]表明，这两类细菌与浮游植物尤其是蓝藻之间关系密切，较为适应在高营养盐水体中生长和繁殖. 该研究也发现Hgcl_clade与ρ(NH4+-N)和ρ(NO3-N)均呈显著正相关，与已有研究结果[53]极为吻合.

综上，虽然细菌群落组成在中度富营养湖泊和重度富营养湖泊中具有显著的差异，但其仍具有相似的优势种，如Hgcl_clade和CL500-29_marine_group在两种湖泊中均无显著性差异. 因此，笔者推测富营养化可能通过改变细菌群落中的稀有种组成进而影响其演替方向. 该研究结果也支持该假设：丰富种的亚群落在这两种湖泊中无显著性差异，而稀有种的亚群落则具有明显的区别. 已有研究[53-54]发现，丰富种和稀有种对环境变化表现出了不同的响应过程. 虽然稀有种的相对丰度较少，但其在细菌群落中扮演着极为重要的作用. 一方面，稀有种是基因多样性和物种多样性的“种子库”[55]；另一方面，其还影响着细菌群落功能特征，如提供降解特定底物的酶等[56]. 然而到目前为止，丰富种和稀有种对细菌群落演替过程的影响机制尚未明确，仍需进一步的研究.

在中度富营养湖泊和重度富营养湖泊的细菌群落分子网络中，分别92.90%和74.45%的物种之间为正相关关系，与其他生境中细菌群落分子生态网络特征相符. 如ZHAO等[30]通过构建我国6个城市湖泊水体的细菌群落分子生态网络，发现群落中大部分物种之间为正相关关系；另外，在附着于地衣和苔藓表面的细菌分子生态网络中，80%的物种之间也为正相关关系[57]. 这种正相关关系可被认为是细菌种群之间存在共生、共栖、以共聚集等关系[28]，因此，这些结果可能表明细菌群落具有自我组织和自我维持的特性[58-59].

虽然这两种生态网络之间具有这些共同特征，网络分析结果仍然表明，中度富营养湖泊中细菌群落分子生态网络(节点和边)要小于重度富营养湖泊，说明在资源更丰富的生态环境中，更多的物种会参与群落功能的行使过程. 值得注意的是，该研究发现在这两种生境中，细菌群落的α多样性并无差别. 因此，环境条件对细菌群落功能的影响要大于其多样性. 那么资源是如何决定细菌群落的功能作用呢？笔者认为，在资源相对贫乏的中度富营养湖泊中，当细菌群落将那些易于利用的物质消耗后，细菌物种间会增加彼此之间的协同作用，通过协同代谢等互助关系来分解或者合成环境中难以利用的物质[60]. 这也可以从该研究的结果中得到证实：中度富营养湖泊中细菌群落分子生态网络拥有92.90%的正相关关系的边，而其在重度富营养湖泊中的生态网络中仅有74.44%；另外，前者网络的中心性参数要显著大于后者. 这也证明了随着富营养化程度的增加，细菌群落微生物之间的相互作用减弱，从而使得网络结构的复杂程度降低[61].

4 结论

a) 长江中下游地区的湖泊可分为中度富营养湖泊和重度富营养湖泊.

b) 在中度富营养和重度富营养湖泊中细菌群落的β多样性具有明显的区别，而α多样性无显著性差异.

c) 两种湖泊中细菌群落的优势种基本一致，在纲水平上以Actinobacteria，Acidimicrobiia，Sphingobacteriia和Betaproteobacteria为主，在属水平上以Hgcl_clade和CL500-29_marine_group为主.

d) 细菌群落主要受到了环境因素〔ρ(TN)、ρ(NH4+-N)及ρ(TSS)〕的影响，与地理距离之间并无显著关系.

e) 中度富营养湖泊中细菌群落生态网络的节点和边数量均小于重度富营养湖泊，并且前者网络具有更多的物种协作关系，其网络的中心性也显著大于后者.