烟草“8306”NtCPS2 基因敲除及叶面化学成分改良

李旖梅，王召军，闫筱筱，张洪映，李雪君，孙计平，黄明月，崔红*

1 河南农业大学烟草学院，郑州市文化路95号 450002；

2 河南省农业科学院烟草研究所，河南省许昌市魏都区青梅路与永昌大道交叉口 461000；

3 四川中烟工业有限责任公司长城雪茄厂，四川省德阳市什邡市蓥华山路南段128号 618400

烟草叶面化学成分丰富，主要由二萜化合物、蔗糖酯、蜡质、微元素、挥发性化合物等构成[1]。其中，二萜化合物和蔗糖酯在叶面腺毛中特异地合成，作为腺毛分泌物构成了叶面化学成分的主要部分[2]。烟草二萜化合物由西柏烷类化合物和赖百当类化合物组成，作为重要的香气前体物，二者对烟叶香气品质具有不同的影响[3]。西柏三烯二醇是主要的西柏烷类化合物，其降解产物茄酮具有青香、草香及其转化产物茄醇、茄尼呋喃、降茄二酮等具有甜香和酮香等特殊的香味；顺冷杉醇、赖百当二醇是主要的赖百当类化合物，其降解产物降龙涎香醚、龙涎香内酯、脱氢龙涎香内酯等都具有强烈的龙涎香香气[3]。西柏烷类和赖百当类化合物在不同烟草类型之间的分布也不相同。西柏烷类化合物在烤烟、白肋烟、雪茄烟、香料烟中广泛存在，但在烤烟中含量最高；赖百当类化合物则主要存在于香料烟和雪茄烟中，烤烟中基本不含有赖百当类化合物[4]。二萜化合物的不同特性及其在不同烟草类型之间的显著差异，表明其与烟草的香气风格密切相关。

8306 是以叶面化学成分为目标选育出来的烤烟品系，其叶面腺毛分泌物含量远远高于K326、云烟87 等烤烟品种[5]。以其为父本与K326 杂交选育出来的杂交种“豫烟11”具有高分泌、高香气的特点[6]。但其香气风格具有晾晒烟的特征，在一定程度上影响了其工业可用性。李艳华[7]等对我国主要烤烟品种叶面化学成分的比较分析表明，红花大金元、中烟100、翠碧1 号和K326 等品种的二萜化合物主要是西柏烷二萜，包括α，β-西柏烷三烯一醇和α，β-西柏烷三烯二醇，唯有在豫烟11 中检测到了顺冷杉醇和赖百当二醇的存在；进一步对二萜化合物合成关键基因的表达分析证明，烟草柯巴基焦磷酸合酶（copalyl diphosphate synthase 2，NtCPS2），仅在豫烟11 中呈现出高表达，而在其余4 个烤烟品种中的表达水平极低。由此推测，NtCPS2 基因的高表达是导致豫烟11中赖百当类化合物的合成及晾晒烟风格产生的关键，而该性状主要来源于其父本8306，与其母本K326无关。

NtCPS2 是烟草赖百当二萜合成的关键酶，它催化焦磷酸香叶基香叶酯（geranylgeranyl-PP，GGPP）形成8-羟基-古巴内脂焦磷酸（8-α-hydroxy-copalylpyrophophate，简称8-OH-CPP），在NtABS 的催化作用下，生成顺冷杉醇和赖百当二醇[8]（如图1）。

图1 烟草二萜合成途径Fig. 1 The biosynthetic pathway of tobacco diterpenes

8306 作为重要的高分泌型烤烟育种材料，阻断其赖百当类化合物的生物合成，定向改良其叶面化学成分，对烤烟高香气育种具有重要意义。因此，本研究采用基因编辑技术敲除8306 中的NtCPS2 基因，对获得的NtCPS2 基因纯合突变材料进行了农艺性状、叶面化学和基因表达等检测分析，为豫烟11 的香气品质改良及高香气烤烟选育奠定了基础。

1 试验材料和方法

1.1 试验材料

供试材料烟草8306 种子，经无菌水、75%酒精和次氯酸钠消毒后，在组培瓶中萌发成苗。无菌苗培养温度为25℃，湿度为60%，光照条件为16 h 光/8 h 暗。

1.2 试验方法

1.2.1 NtCPS2 敲除载体的构建和菌株转化

根据茄科基因组网站（https://solgenomics.net/）已发表的烟草NtCPS2基因序列（Nitab4.5_0001630g0010.1、Nitab4.5_ 0006403g0010.1）， 利 用 CRISPR2 在 线软 件（http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/） 设 计gRNA 序列，选择位于308 bp 至329 bp 之间的序列5’-TGTTGAATTCGATGGAGGATGG-3’为靶标序列，人工合成Oligo 二聚体与CRISPR/Ca9 敲除载体[9]进行连接。反应体系如下：CRISPR/Ca9 载体2.0 μL，Oligo 二 聚 体 1.0 μL，Enzyme Mix 1.0 μL， 无 菌 水H2O 补充至 10.0 μL。冻融法转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，涂布于含有卡那霉素的LB 固体培养基上，挑取白斑进行菌液PCR 抗性检测。提取重组质粒，将其转化到根癌农杆菌EHA105 中，用于共培养转化。

1.2.2 烟草遗传转化与分子鉴定

采用叶盘法[10]转化烟草8306。取农杆菌EHA105 菌液侵染叶圆片，在MS 培养基上共培养48 h 后转移到分化培养基（MS+NAA 0.15 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+Hyg 8 mg/L+Cef 500 mg/L) 上 进行培养，待芽长至2 cm 时剪下转移到生根培养基（MS+NAA 0.10 mg/L+Hyg 8 mg/L） 中 生 根 成苗。提取抗性苗叶片DNA，利用NtCPS2 特异引物（F1:GTTAAATGAAATCATAGCGGAATTG；R1:ACACGTCTTACTT GTGATAATGTT）进行PCR扩增，回收扩增产物（莱枫生物试剂盒），由金唯智公司进行序列测定。

阳性植株自交收种，漂浮育苗至三叶一心，采用CTAB法提取T1代单株叶片的DNA，利用潮霉素抗性基因特异引 物（F2：CGAGAGCCTGACCTATTG CAT，R2 ：CTGCTCCATACAAGCCAACCAC）进行PCR扩增，对T1代单株进行分子鉴定，筛选出无潮霉素抗性基因的单株自交留种，用于田间试验和性状分析。

1.2.3 RT-PCR 分析

分别选取8306 和8306-1 的5 cm 长的幼嫩叶片，Trizol 法提取总RNA，反转录成cDNA，以烟草L25 核糖体蛋白（L18908）为内参基因，采用半定量PCR 技 术， 对 NtDXS、NtDXR、NtCMS、NtCMK、NtMCS、NtHDS、NtIPI1、NtGPPS、NtGGPPS、NtCPS2、NtABS、NtCYC 和 NtCYP71D16 等基因的表达水平进行比较分析。引物序列设计如下表所示：

表1 扩增引物序列Tab. 1 Amplification of primer sequences

1.2.4 农艺性状调查

8306 及其NtCPS2 基因敲除纯合去载体的株系8306-1 进行漂浮育苗，于2019 年5 月5 日移栽至河南省农科院烟草研究所试验田。按照当地优质烟叶栽培规程进行大田管理，并在现蕾期进行农艺性状指标的测量[11]。

1.2.5 腺毛形态学观察及密度统计分析

选取长10 cm 左右的幼叶，从叶尖向叶基数第四脉和第五脉间之间取样，叶片腺毛组织化学染色法参考 Lin 和 Wagner 的方法[12]。将叶片在 0.2%（w/v）罗丹明B 水溶液中浸染30 min，用蒸馏水漂洗三次，使用无菌滤纸吸干表面水分后，利用超景深显微镜（基恩士VHR-5000，日本）对叶片表面进行观察，并在上表皮中部随机选择3 个视野进行腺毛形态拍照和腺毛密度统计分析。

1.2.6 叶面化学成分分析

取叶龄为60 天的中部烟叶（10～12 叶位）进行叶面分泌物的提取。样品的制备及前处理参考韩锦峰等[13]的叶圆片法。在二氯甲烷溶液中浸提，浸提液加入1 mL 内标（2.020 mg/mL 的蔗糖八乙酸酯和 2.542 mg/mL 的正十七烷醇的混合溶液）后过滤，在旋转蒸发仪中浓缩后，在氮气保护下将溶剂吹干。加入500 μL 1 :1（V : V）DMF : BSTFA，75℃水浴中进行衍生化反应60 min，然后加入N,O-双乙酰胺和吡啶各125 μL。采取GC/MS 分析仪（美国Agilent 公司，色谱仪型号HP-5890，质谱仪型号vc-70SE）进行样品化学成分的定性和定量分析，色谱参数检测参考王霄龙等[14]的方法,采用内标定量法（相对校正因子为1）进行定量分析。

1.2.7 数据处理和统计方法

所有数据使用EXCEL 进行整理，使用SPSS17.0软件（IBM，美国）进行差异显著性分析，数据处理采用单因子方差（One-way ANOVA）分析。

2 结果与分析

2.1 烟草8306 NtCPS2 基因突变体的创制和分析

构建NtCPS2 敲除载体转化农杆菌菌株EHA105，并对8306 叶片进行侵染，在含有潮霉素（8 mg/L）的筛选培养基上进行分化。利用NtCPS2 基因特异引物对潮霉素抗性植株进行PCR 扩增和产物测序。在所检测的42 株抗性苗中，有19 株在gRNA 区域出现双峰现象，基因编辑效率接近45.2%。其中，编号为C13 的植株在第324 位置插入A，发生了单碱基插入的纯合突变（图2），致使翻译提前终止，NtCPS2基因表达蛋白合成受阻。自交收种后对T1 代进行潮霉素基因检测，筛选NtCPS2 基因发生纯合突变且无转基因元件的株系，自交收种，并命名为8306-1。

图2 8306NtCPS2 基因敲除植株gRNA 序列分析Fig. 2 gRNA sequencing analysis of 8306 plant with NtCPS2 gene knockout

2.2 NtCPS2 基因突变对烟株农艺性状的影响

为比较NtCPS2 基因敲除对烟株生长发育的影响，将8306 和8306-1（T2 代）在河南省农业科学院烟草研究所试验田进行种植。田间观察发现，在整个生育期中，8306-1 与8306 的生长发育状况基本一致（如图3）。在现蕾期对各项农艺性状指标进行了调查，结果见表2。可以看出，株高、茎围、节距、最大叶长、最大叶宽和有效叶数上，8306-1 和8306 之间并无差异。

2.3 NtCPS2 基因敲除对腺毛发育的影响观察

在烟株幼苗期分别对8306 和8306-1 幼叶进行叶面腺毛形态观察和密度统计，结果如图4。可以看出，8306-1 与对照8306 的叶面腺毛均由长柄分泌型、短柄分泌型和非分泌型3 种类型组成，且均以长柄分泌型为主；长柄腺毛分泌旺盛，其分泌物能被罗丹明染成红色。对腺毛密度的统计结果可以看出，8306-1 与对照8306 相比，无论是腺毛总量还是腺毛不同类型，腺毛密度都没有显著差异，说明NtCPS2 基因的表达对烟草腺毛发生并无影响。

图3 田间植株形态观察Fig. 3 Plant Morphology Observation of 8306 and 8306-1 in Field

表2 8306 和8306-1 农艺性状调查结果Tab. 2 Comparison of agronomic traits between 8306 and 8306-1

图4 8306 和8306-1 腺毛形态及腺毛密度Fig. 4 Comparison of trichome morphology and density between 8306 and 8306-1

2.4 NtCPS2 基因突变对烟草叶面化学成分的影响

对叶龄为60 天的中部叶片进行叶面化学成分萃取和GC/MS 检测分析，结果如图5 所示。从质谱图可以看出，NtCPS2 基因突变对叶面化学组成成分产生了明显影响：8306 的主要叶面化学成分为α，β-西柏三烯一醇、α，β-西柏三烯二醇、顺冷杉醇、赖百当二醇和蔗糖酯，而8306-1 主要化学成分为α，β-西柏三烯一醇、α，β-西柏三烯二醇和糖酯，保留时间为42.89 min 的顺冷杉醇峰和保留时间为54.23 min的赖百当二醇峰明显缺失，说明其不含赖百当类二萜。从含量上看，8306-1 和8306 相比，西柏烷类二萜、蔗糖酯及叶面化学成分总含量均没有显著差异，而赖白当类二萜则呈极显著差异，可见，NtCPS2 基因突变可以有效抑制赖百当类二萜的生物合成，对其它叶面化学成分无明显影响。

图5 8306 与8306-1 叶面化学成分检测分析Fig. 5 Detection and analysis of leaf surface chemical components between 8306 and 8306-1

2.5 NtCPS2 基因突变对烟草二萜代谢相关基因表达的影响

为阐明NtCPS2 基因突变对烟草萜类代谢的影响，采用RT-PCR 技术对二萜代谢及MEP 途径关键基因的表达水平进行了检测分析。从图6 可以看出，在8306 与8306-1 中，类萜前体物质IPP 及DMAPP生物合成的MEP 途径中的关键酶基因NtDXS、NtDXR、NtCMS、NtCMK、NtMCS、NtHDS、NtIPI1的表达水平基本一致，烟草二萜合成关键基因NtCPS2、NtABS、NtCYC、NtCYP71D16 及其上游基因NtGPPS、NtGGPPS 的表达，在转录水平上亦无明显差异。这说明NtCPS2 基因突变并不影响烟草类萜合成相关基因的表达，除了赖百当化合物合成受阻之外，其它萜类代谢流向稳定。这与叶面化学成分的检测结果相吻合。

3 结论与讨论

烟草二萜化合物在烟草长柄腺毛中特异合成并向叶表面分泌，构成了烟草叶面化学的主要成分。目前已知的烟草二萜化合物主要包括西柏烷和赖百当两大类，二者在不同类型烟草间的分布不同[15]，是其烟叶香气风格特征形成的原因之一。烤烟中二萜化合物以西柏烷类为主，大多数主栽品种中不含赖百当化合物，但在豫烟11 中检测到了顺冷杉醇和赖百当二醇的存在，推测这是导致该品种具有“特香型风味”的主要原因[7]。由于豫烟11 是由8306 和K326 杂交而成，而K326 本身不含有赖百当二萜，因此对8306 叶面化学的改良是恢复豫烟11 典型烤烟风格的关键。同时，作为重要的高香气育种材料，8306 叶面化学成分的定向改良对高香气烤烟育种也具有重要意义。

图6 二萜合成途径及半定量PCR 分析Fig. 6 Semi-quantitative PCR analysis of terpene synthesis genes between 8306 and 8306-1

NtCPS2 是烟草赖百当二萜合成的关键酶基因。Sallaud[8]等研究发现，烤烟中NtCPS2 基因第4 外显子的碱基突变导致翻译提前终止，是烤烟中赖百当二萜合成受阻的根本原因。本研究利用CRISPR/ CAS9技术对NtCPS2 基因进行编辑，其纯合突变株系8306-1 腺毛发育正常，但叶面化学成分中顺冷杉醇和赖百当二醇明显缺失，这与Sallaud 等人的研究结果相符，证明NtCPS2 是调控烟草赖百当二萜生物合成的关键基因。考虑到西柏烷二萜和赖百当二萜具有相同的底物GGPP，赖百当合成受阻理论上应该会引起西柏烷二萜含量的提高，但本研究结果显示8306-1中西柏烷二萜、蔗糖酯含量及叶面化学总量与对照相比并无显著变化。这可能是由于烤烟中赖百当二萜的含量远远低于西柏烷二萜，抑制其合成对西柏烷二萜合成不会造成明显影响。RT-PCR 分析结果显示8306与8306-1 中IPP 及二萜合成相关基因的表达水平基本不变，这也证明了NtCPS2 基因突变除了抑制赖百当二萜合成之外，对烟草类萜整体代谢流向影响不大，加之NtCPS2 基因突变后烟株生长发育和农艺性状正常，因此认为该基因是进行烟草叶面化学成分定向改良的理想靶点。

烟草8306 是河南农业大学杨铁钊课题组以腺毛分泌物为目标选育出的育种材料，在烤烟高香气育种中发挥重要作用。通过NtCPS2 基因突变来抑制8306中赖百当二萜的生物合成，有利于彰显典型的烤烟香气风格、扩大其在高香气烤烟育种中应用范围。另外，在对8306 叶面化学成分进行定向改良的基础上还可以对其腺毛密度进行分子改良，进一步提高西柏烷二萜和蔗糖酯等腺毛分泌物的含量，创制高分泌型育种材料，为高香气烤烟育种奠定基础。