丹参-黄芪配伍对急性心肌缺血模型小鼠的影响及作用机制※

张立新 段立楠 刘晓丽 焦丽璇 李茜茜 耿艳华 陈 燕

(石家庄医学高等专科学校中医教研室，河北 石家庄 050599)

药对是以一定证候特点及相应治法为前提，根据药物的性味归经、升降沉浮，选择性地将2味中药进行配对[1]。药对是组成中药复方的基础，其组成虽简单，但具备配伍的基本特点，是联接单味中药与复方的桥梁，复方研究常从药对入手。丹参-黄芪是临床常用药对，其中丹参为活血化瘀药，黄芪为补气升阳药，两药配伍有益气活血的功效，常用于冠心病、心绞痛的治疗[2]。本研究通过复制急性心肌缺血小鼠模型，观察丹参-黄芪配伍对其的影响，并对其作用机制进行初步探讨，结果如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 C57BL/6小鼠50只，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，动物许可证号：1103241911029433，体质量(18±2) g，雄性，SPF级。饲养于恒温恒湿，独立通气笼具(IVC)中，灭菌饲料饲养，自由饮用灭菌双蒸水。

1.1.2 试剂与试药 丹参、黄芪药材均购自河北省中医院，由主任中药师鉴定为正品来源。丹参组、黄芪组分别取相应药材，加水煎煮2次并浓缩成1 g生药/mL药液；配伍组为丹参、黄芪药材等比配伍，合煎并浓缩成1 g生药/mL药液。垂体后叶注射液(安徽宏业药业有限公司，国药准字H34022977，批号190314)。胶原蛋白酶，美国ROCHE公司；细胞内Ca2+荧光探针Fluo-4 AM，美国Sigma公司；肌球蛋白轻链20(myosin light chain 20，MLC20)抗体(货号ab94730)、磷酸化肌球蛋白轻链(Phospho-MLC20，p-MLC20)抗体(货号ab2480)，美国Abcam公司；蛋白裂解液，上海贝博生物科技有限公司；超敏电致化学发光(ECL)试剂盒，苏州新赛美生物科技有限公司；蛋白上样缓冲液，北京普利莱基因技术有限公司；十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)，美国Sigma公司。

1.1.3 实验仪器 激光共聚焦显微镜，美国Leica公司；体式显微镜，日本Olympus公司；迷你电泳仪，美国Bio-Rad公司；ECL仪，法国Vilber Lourmat公司；Ion Optix单细胞边缘检测系统，美国Ion Optix公司；ECG6511心电图机，广州艾迪科逊医疗器械有限公司；HW-400恒温平滑肌槽，成都泰盟科技有限公司；迷你电泳槽、042BR-06571电泳仪，伯乐生命医学产品(上海)有限公司；FR0149多功能成像分析仪，普诺森生物科技(上海)有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 分组、给药及造模 将50只C57BL/6小鼠，随机分为空白组、模型组、丹参组(20 g生药/kg体质量)、黄芪组(20 g生药/kg体质量)和配伍组(丹参、黄芪配伍20 g生药/kg体质量)，每组10只。丹参组、黄芪组和配伍组分别予相应药液20 mL/kg体质量灌胃，空白组和模型组予等容积蒸馏水灌胃。给药1 h后，模型组和各给药组分别予垂体后叶注射液25 U/kg体质量腹腔注射，空白组予等容积0.9%氯化钠注射液腹腔注射，每日1次，连续7 d。

1.2.2 心电图检测 末次给药20 min后，各组小鼠予乌拉坦10 mg/kg体质量腹腔注射麻醉，用心电图机检测小鼠心电图ST段J点上移幅度和心率。

1.2.3 心肌细胞急性分离 将麻醉后的各组小鼠仰面固定，开胸，剪取带有主动脉的心脏组织，在体式显微镜下将周围血管和脂肪清除干净，保留主动脉弓。将心脏悬挂于灌流装置下端，37 ℃恒温Ⅱ型胶原酶液循环灌流30 min，待心脏体积增加，质地变软后取下，剪去动脉、心耳及心房等组织，将剩余的心室组织置于KB液中，撕成碎片。碎片组织用吸管反复吹打为单细胞后，用200目筛网过滤，静置30 min，备用。

1.2.4 心肌细胞收缩检测 将分离好的心肌细胞置于1.8 mmol/L Ca2+Tyrode′s solution中孵育10 min，置于显微镜下，予10 V、1 Hz的电场刺激，以Ion Optix单细胞边缘检测系统检测并计算心肌细胞肌小节长度收缩百分率，以评价心肌细胞的收缩舒张功能。

1.2.5 心肌细胞钙瞬变幅度和钙回收速率检测 配制游离Ca2+荧光探针孵育液，在1.8 mmol/L Ca2+Tyrode′s solution中加入Pluronic F-127和Fluo-4 AM。将急性分离的小鼠心肌细胞室温孵育游离Ca2+荧光探针30 min。在激光共聚焦显微镜下每组随机选择细胞，观测细胞内荧光强度及其变化情况，即心肌细胞钙瞬变幅度和钙回收速率。

1.2.6 心肌细胞MLC20磷酸化水平检测 取小鼠心肌细胞200 μL，加入蛋白裂解液裂解0.5 mL，用破碎仪匀浆，离心后取上清，并用酶标仪蛋白定量，5×蛋白上样缓冲溶液，煮沸5 min使蛋白变性，采用Western blotting法检测心肌细胞中MLC 20磷酸化蛋白和总蛋白表达。取细胞裂解液进行SDS-PAGE凝胶电泳。将电泳后的蛋白25 V恒压30 min转至聚偏二氟乙稀(PVDF)膜，8%脱脂奶粉常温封闭2 h，加入相应的一抗(1∶1 000)4 ℃过夜。洗膜后，加入稀释的二抗(1∶10 000)常温1 h，再次洗膜后进行化学发光，并扫描、拍照，分析相应蛋白条带的灰度值，p-MLC20与MLC20灰度值比值即为MLC20磷酸化水平。

2 结 果

2.1 各组小鼠心电图ST段J点上移幅度和心率比较 见表1。

由表1可见，与空白组相比，模型组小鼠心电图ST段J点上移幅度显著增大(P<0.01)，心率显著加快(P<0.01)。与模型组相比，丹参组、黄芪组和配伍组小鼠心电图ST段J点上移幅度均显著减小(P<0.01)，心率减慢(P<0.01，P<0.05)。与配伍组相比，丹参组心电图ST段J点上移幅度增大(P<0.05)，心率无明显变化(P>0.05)；黄芪组心电图ST段J点上移幅度显著增大(P<0.01)，心率加快(P<0.05)。

表1 各组小鼠心电图ST段J点上移幅度和心率比较

2.2 各组小鼠心肌细胞肌小节长度收缩百分率比较 见表2。

表2 各组小鼠心肌细胞肌小节长度收缩百分率比较

由表2可见，与空白组相比，模型组小鼠肌小节长度收缩百分率明显升高(P<0.05)。与模型组相比，丹参组、配伍组小鼠肌小节长度收缩百分率降低(P<0.05，P<0.01)，黄芪组虽无统计学意义(P>0.05)，但也有降低趋势。配伍组小鼠肌小节长度收缩百分率与丹参组、黄芪组比较差异均无统计学意义(P>0.05)，但也有降低趋势。

2.3 各组小鼠心肌细胞钙瞬变幅度和钙回收速率比较 见表3。

表3 各组小鼠心肌细胞钙瞬变幅度和钙回收速率比较

由表3可见，与空白组相比，模型组小鼠心肌细胞钙瞬变幅度明显增大(P<0.05)，钙回收速率明显加快(P<0.05)。与模型组相比，丹参组、黄芪组和配伍组小鼠心肌细胞钙瞬变幅度均明显降低(P<0.05)；丹参组和配伍组钙回收速率均明显减慢(P<0.05)，黄芪组虽无统计学意义(P>0.05)，但也有减慢趋势。配伍组小鼠心肌细胞钙瞬变幅度和钙回收速率与丹参组、黄芪组比较差异均无统计学意义(P>0.05)，但有减小趋势。

2.4 各组小鼠心肌细胞MLC20磷酸化水平比较 见图1，表4。

图1 各组小鼠心肌细胞MLC 20磷酸化水平比较

表4 各组小鼠心肌细胞MLC 20磷酸化水平比较

由图1、表4可见，与空白组相比，模型组小鼠心肌细胞中MLC20的磷酸化水平显著升高(P<0.01)。与模型组相比，丹参组、黄芪组和配伍组小鼠心肌细胞MLC20磷酸化水平均显著降低(P<0.01)。配伍组小鼠心肌细胞MLC20磷酸化水平显著低于丹参组和黄芪组(P<0.01)。

3 讨 论

急性心肌缺血是由多种原因引起的心肌相对或绝对供血不足，心肌细胞缺氧，临床表现为急性心肌梗死、突发心绞痛，可危及患者生命[3]。急性心肌缺血属中医学“胸痹”“心痛”范畴，基本病机为气滞血瘀，多以活血化瘀、益气活血为法治疗[4]。张仲景《伤寒杂病论》云“干血不去，则足以留新血而灌溉不周”。气为血之帅，血为气之母，血液在脉中循行有赖于心气的鼓动，故而在治疗血瘀证时多以活血药和补气药配伍[2]。本研究项目组通过对近年的临床文献进行统计分析发现，丹参-黄芪是治疗冠心病心绞痛使用频率最高的药对之一[5-6]。丹参味苦性微寒，具有活血调经、祛瘀止痛、凉血消痈、除烦安神的功效，为活血化瘀的要药。黄芪味甘性微温，具有补气升阳、行滞通痹、利水消肿的功效，为升阳补气之圣药。两药等比配伍，益气活血之功力宏，常用于冠心病、心绞痛的治疗，临床上治疗此类疾病的芪参益气滴丸、芪参胶囊均为丹参-黄芪的配伍[7-8]。药理学研究发现，丹参、黄芪抑制心肌收缩、缺血时心脏保护的作用皆与钙拮抗有关[9-10]。因此，本研究对丹参-黄芪配伍抗急性心肌缺血的作用进行评价，并从钙调控、抑制心肌细胞收缩的角度对两药配伍抗心肌缺血的作用机制进行探讨。

垂体后叶素能够作用于加压素受体，引起冠状动脉痉挛，导致心肌供血不足和心肌损伤，全身小血管收缩，造成心脏后负荷加重，引起心肌缺血[3]。本研究连续7 d给小鼠腹腔注射垂体后叶可复制急性心肌缺血模型。模型组小鼠心电图表现出明显的ST段J点抬高，心率加快(P<0.05)。予丹参、黄芪及两药配伍水煎液干预后，小鼠心电图ST段J点降低，心率减慢，且两药配伍的效果优于单独使用。

本研究还从心肌细胞收缩和钙调控角度对丹参-黄芪配伍抗急性心肌缺血的作用机制进行初步的研究。研究发现，丹参、黄芪和两药配伍干预均能显著降低小鼠心肌细胞收缩力，表现为肌小节长度收缩百分率降低(P<0.05)。现代生理学研究显示，心肌细胞浆内Ca2+浓度的变化与细胞收缩密切相关。心肌兴奋时，细胞外Ca2+通过L型钙通道进入胞浆，并触发肌浆网内钙释放，使胞浆中Ca2+浓度迅速上升[11]。继而，Ca2+又被钙泵泵回肌浆网或排出细胞，使胞浆内Ca2+浓度降低。胞浆内Ca2+浓度升高能够与钙调蛋白(calmodulin，CaM)形成复合体，通过激活肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase，MLCK)使MLC20发生磷酸化，引发肌动蛋白和肌球蛋白相互作用，导致心肌收缩[12]。可见，心肌细胞浆内的Ca2+浓度与细胞收缩程度有关，Ca2+浓度变化速率与细胞收缩频率有关。因此，本研究以钙瞬变幅度和钙回收速率评价心肌细胞浆内Ca2+浓度的变化情况。其中，钙瞬变幅度用F/F0(即钙瞬变曲线的峰值与基线的比值)表示，比值越大说明钙瞬变幅度越大，心肌细胞浆内的Ca2+最高浓度越大；心肌细胞钙回收速率则与钙回收的速度有关，该值越大，表明钙回收速率越慢[13-15]。本研究发现，丹参、黄芪和两药配伍均可降低钙瞬变幅度，减慢钙回收速率，使MLC20的磷酸化程度降低，且两药配伍效果更好。进一步证实丹参、黄芪有钙拮抗作用，且两药能够协同生效。

综上所述，丹参、黄芪均对小鼠实验性急性心肌缺血有较好的改善作用，且两药配伍应用的效果更好。其机制与降低钙瞬变幅度，减慢钙回收速率，降低MLC20的磷酸化程度，从而抑制心肌细胞收缩，减慢心率有关。