Gene Xpert MTB/RIF检测在结核性胸膜炎诊断及利福平耐药检测中的应用价值

黄大业，张毅，张建华，郭琪

西安市胸科医院外科，陕西 西安 710000

尽管结核病是一种可预防和可治愈的疾病，但它仍然是全球十大死亡原因之一，并且是最常见的传染性死亡原因；中国是结核病发病率较高的国家之一，每年新增结核病例约91.8万例[1]。结核性胸膜炎作为肺外结核最常见的结核病之一，发病率也是逐年上升[2]，结核性胸膜炎如不及时诊断及治疗，常常发展成结核性脓胸[3]，导致患者肺功能严重受损，所以早期诊断结核性胸膜炎就成为了一个重要课题。传统的耐多药结核病诊断技术通常涉及一个漫长而艰巨的过程，需要在临床样本中分离分枝杆菌，鉴定结核分枝杆菌复合体，然后进行体外分析，以确定菌株对抗结核药物的敏感性[4]。Gene Xpert MTB/RIF检测(简称Xpert检测)是一种基于实时聚合酶链反应(RT-PCR)的分子诊断试验，是世卫组织认可的用于检测结核分枝杆菌和多药耐药的唯一快速诊断试验[5]。本文旨在研究Xpert检测在早期诊断结核性胸膜炎及利福平耐药检测中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年7月1日至2018年7月31日在西安市胸科医院住院治疗的86例结核性胸膜炎患者，其中男性50 例，女性36 例；年龄16~72 岁，平均43.5 岁。诊断标准：有结核接触史或肺结核病史，发病缓慢，有午后低热、乏力、盗汗、咳嗽、胸闷气短等结核毒性症状，PPD(结核菌素试验)、T-SPOT(结核菌感染T 细胞斑点试验)、结核抗体等检测阳性，胸部影像学符合结核性胸膜炎诊断，抗结核治疗有效。另选取同期34 例诊断为非结核胸膜炎患者(非结核组)，其中男性20 例，女性14 例；年龄17~65 岁，平均40.3 岁；参照人民卫生出版社第六版内科学《胸腔积液》诊断标准，其中恶性胸腔积液20例，类肺炎性胸腔积液14 例。所有病例通过临床治疗转归并综合胸膜活检、胸水脱落细胞、胸水细菌培养等各项检查结果后最终确诊。本研究经伦理委员会的批准，所有患者均签署了知情同意书。

1.2 实验仪器与试剂 Xpert MTB/RIF仪器与试剂均购自美国Cepheid 公司，BACTEC MGIT 960系统与试剂均购自美国BD 公司；分枝杆菌涂片镜检萋尼染色液购自珠海贝索生物技术有限公司。

1.3 标本留取 所有患者入院后行B 超引导下穿刺或胸腔镜手术，留取胸腔积液送检验科，分别行抗酸染色、BACTECMGIT960 液体快速培养、荧光定量PCR和Xpert检测。

1.4 统计学方法 应用SPSS19.0 统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验；计数资料比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义；一致性检验采用Kappa 检验，以K>0.4为两者一致性较好。敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%；符合率=(真阳性例数+真阴性例数)/总例数×100%；YOUDEN 指数=敏感度+特异度－1；阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%；阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%。

2 结果

2.1 不同方法检测结果

2.1.1 结核组 Xpert检测56例阳性，30例阴性；抗酸染色7 例阳性，79 例阴性；BACTECMGIT960 液体快速培养18例阳性，68例阴性；荧光定量PCR 54例阳性，32例阴性，结果显示Xpert检测阳性率较其他三种检测方法阳性率高，差异有显著统计学意义(χ2=91.14，P<0.01)。

2.1.2 非结核组 Xpert 检测0 例阳性，34 例阴性；抗酸染色0 例阳性，34 例阴性；BACTECMGIT960 液体快速培养0 例阳性，34 例阴性；荧光定量PCR 2 例阳性，32 例阴性，结果显示Xpert 检测阳性率较其他三种检测方法阳性率差异无统计学意义(χ2=6.09，P=0.11)。

2.2 不同检测方法对结核性胸膜炎的诊断效能评价 以胸膜活检病理诊断或经治疗后随诊证实为结核性胸膜炎或非结核性胸膜炎为标准，胸腔积液Xpert 检测的敏感度、特异度、符合率、阳性预测值及阴性预测值分别为65.1% (56/86)、100.0% (34/34)、75.0%(90/120)、100.0%(56/56)、53.1%(34/64)，相对于其他3种方法，Xpert检测符合率、敏感度最高，与抗酸染色和BACTECMGIT960 液体快速培养比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 不同检测方法对结核性胸膜炎的诊断效能评价(%)

2.3 不同方法获取胸腔积液行Xpert检测的结果比较 B 超穿刺组74 例中，结核性胸膜炎Xpert 检测阳性36 例，阴性18 例，非结核组Xpert 检测阳性0 例，阴性20例，敏感度为66.7%，特异度为100.0%；开放手术组46 例中，结核性胸膜炎Xpert 检测阳性20 例，阴性12 例，非结核组Xpert 检测阳性0 例，阴性14 例，敏感度为62.5%，特异度为100.0%；两组比较差异无统计学意义(χ2=3.85，P=0.92)，见表2。

表2 不同方法获取标本行Xpert检测的结果(例)

2.4 Xpert 检测及BACTEC MGIT 960 药敏试验检测利福平耐药情况 86份胸腔积液标本两种检测方法均为阳性者共18例，以BACTEC MGIT 960 液体快速培养药敏试验结果为金标准，Xpert 检测18 例利福平耐药结果的敏感度为80.0% (4/5)、特异度为69.2%(9/13)，阳性预测值为50.0%，阴性预测值为90.0%。对Xpert检测和BACTECMGIT 960液体快速培养药敏试验进行Kappa检验，K=0.559，两者检测结果一致性好。

3 讨论

结核病是一种发病率和死亡率都很高的传染病[6]，早期发现和治疗，可有效降低结核病的传染性和死亡率[7]。结核性胸膜炎是由结核分枝杆菌(MTB)直接感染和(或)胸膜对结核分枝杆菌感染产生高度变态反应而发生的炎症[8]。作为最常见的肺外结核病，其发病率约占所有结核病病例的25%[9]。人类胸膜分为壁层胸膜和脏层胸膜，壁层胸膜间皮细胞间存在淋巴管微孔，胸腔内液体由于压力梯度从壁层和脏层胸膜的体循环血管通过有渗漏性的胸膜进入胸膜腔，然后通过壁层胸膜的淋巴微孔经淋巴管回吸收，正常情况下脏层胸膜对胸水循环的作用较小。结核分枝杆菌侵犯胸膜的超敏反应使胸腔内液体产生多于吸收，是结核性渗出性胸膜炎产生的主要机制。在临床上，胸腔积液是结核性胸膜炎早期最常见的体征，但需要与其他原因如炎性胸腔积液、恶性胸腔积液等进行鉴别，所以对胸腔积液的检测在结核性胸膜炎的诊断中尤为重要。胸腔积液的传统检测方法包括：抗酸染色、BACTECMGIT960液体快速培养、荧光定量PCR 等[10]，但各种方法都存在如等待时间长、假阳性率高、敏感度低、特异度差等诸多缺陷[11]。Gene Xpert MTB/RIF检测系统的问世为结核病的早期诊断提供了快速、有效的方法。Gene Xpert MTB/RIF 检测是一种基于巢式PCR 技术发展而来的基因扩增技术[12]，可以针对rpoB 基因81bp 利福平耐药核心区间(RRDR)设计引物、探针，能够在2 h内快速检测是否发生突变，进而用于诊断结核及检测利福平耐药[13]。Xpert 检测是一个封闭式系统，全自动操作，操作简单并且减少了标本污染的可能性[14]；其同时具有检测时间短、敏感度高、特异度高等优点[15]。2013年，世界卫生组织批准Xpert 检测用于诊断成人和儿童的肺外结核[16-18]。有实验研究显示Xpert 检测在脊柱结核、结核性脑膜炎的诊断中具有很高的价值，但是在结核性胸膜炎诊断中的价值研究较少。

本文回顾性分析2016年7月1日至2018年7月31日在西安市胸科医院外科就诊的86 例初步诊断为结核性胸膜炎患者和同期34 例诊断为非结核胸膜炎患者的胸腔积液标本，分别行抗酸染色、BACTECMGIT960 液体快速培养、荧光定量PCR 和Xpert 检测，对比4 种方法检测结核分枝杆菌的敏感度、特异度、符合率等指标；对不同方法获取的胸腔积液标本行Xpert检测，评估不同获取标本方法对Xpert检测结核分枝杆菌效能的影响；以BACTEC MGIT 960 液体快速培养药敏试验结果为金标准，分析Xpert 检测检验利福平耐药的效能，从而研究Xpert 检测在结核性胸膜炎诊断及利福平耐药检测中的应用价值。

3.1 Xpert检测在结核性胸膜炎诊断中的优势 本研究结果显示在结核性胸腔积液中Xpert 检测阳性率较其他三种检测方法阳性率高，差异有统计学意义(χ2=91.14，P<0.01)；胸腔积液Xpert 检测的敏感度(65.1%)明显高于抗酸染色(8.1%)和结核菌培养(20.9%)，与荧光定量PCR(62.8%)差异不明显；但是荧光定量PCR的检测步骤多，容易受操作相关因素的影响而导致检测结果存在一定的假阳性和假阴性，Xpert检测为封闭式自动化系统，操作简单，而且能有效避免标本的污染，从而降低假阳性和假阴性率，更适用于临床。

3.2 不同方法获取标本的Xpert 检测结果对比 SCOTT 等[19]研究显示Xpert 检测在对7 916 例肺外结核的各类标本检测中，脓液标本的浓稀程度对Xpert检测的敏感度会有很大的影响，浓度较高的标本敏感度为87%(95%置信区间为76%~94%)，浓度较低的标本仅为48% (95%置信区间为36%~61%)，那么，不同方法获得的结核性胸膜炎的标本是否会对Xpert检测结果产生影响呢？本研究采用B超穿刺和开放手术两种方法获取胸腔积液标本并进行Xpert 检测，其敏感度分别为66.7%和62.5%，特异度均为100.0%，差异无统计学意义(χ2=3.85，P=0.92)。也就是说不同获取标本的方法对Xpert 检测结果影响不大，但是从对患者创伤、经济、操作难度和风险等方面考虑，B 超穿刺相对于开放手术具有创伤小、花费少、操作简单、风险小等优势，可作为临床上获取结核性胸膜炎标本的首选方法。

3.3 Xpert检测利福平耐药的效能评估 本研究中，以BACTEC MGIT 960液体快速培养药敏试验结果为金标准，Xpert 检测利福平耐药结果的敏感度为80.0%、特异度为69.2%，阳性预测值为50.0%，阴性预测值为90.0%，对Xpert检测结果和BACTECMGIT 960液体快速培养药敏试验结果进行Kappa检验，K=0.559，两者检测结果一致性较好。相对于BACTEC MGIT 960 液体快速培养结果报告时间为(24.58±10.24) d，Xpert 检测结果报告时间大大缩短[(2.4±0.3)h][20]，能让临床医师在早期发现利福平耐药情况，及时调整治疗方案，对患者的治疗产生深远的影响。

综上所述，在结核性胸膜炎的诊断中Xpert 检测具有较高的价值，其明显优于抗酸染色、BACTECMGIT960 液体快速培养、荧光定量PCR，对结核性胸膜炎的早期诊断有很大帮助；同时Xpert 检测能对利福平耐药菌株进行快速检测，其检测效能和结核菌培养药敏试验的结果一致性好，可以作为检测结核性胸膜炎利福平耐药快速、有效的手段；B超穿刺和开放手术两种方法获取胸腔积液标本对Xpert检测结果影响不大。此外，本实验Xpert 检测阳性的56 份的标本中15 份为极低浓度，21 份为低浓度，13 份为中等浓度，7份为高浓度，高浓度标本数量较少。一方面，可能由于胸腔为相对封闭无菌环境，胸腔积液中分枝杆菌含量较少；另一方面，可能是本研究未纳入合并免疫缺陷的患者，入组患者机体免疫力强，巨噬细胞对结核菌的消灭作用强，造成结合分枝杆菌数量少；另外，样本数量少也是影响因素之一。因此，在今后的研究中，可以考虑采用集菌、破膜等方法增加细菌浓度同时增加样本数量从而提高Xpert 检测阳性检出率，进行进一步的验证。