亲土苔蛾成虫复眼超微结构

陈庆霄

(河南科技大学林学院, 昆虫进化与系统学实验室, 河南洛阳 471023)

除少数穴居和寄生性昆虫外，绝大多数昆虫具有一对复眼(compound eyes)，用于感知外界光线，帮助自身进行飞行、觅食、求偶、避敌以及导航等行为(Chapman, 2013)。昆虫的复眼由许多结构相同的小眼(ommatidia)组成，这些小眼的发育受到遗传保守的Pax6基因调控(Gehring and Ikeo, 1999)。复眼高度的结构复杂性与进化保守性已使其成为昆虫纲(Insecta)系统发育以及器官演化研究的重要模型(Caveney, 1986; Melzeretal., 1997; Paulus, 2000; Oakley, 2003; Harzsch and Hafner, 2006; Chenetal., 2012)。

根据昆虫昼夜节律不同，复眼被分为并列型眼(apposition eye)和重叠型眼(superposition eye)两种基本类型，前者常存在于日出型昆虫中，后者多存在于夜出型昆虫中(Kunze, 1979)。这两种类型的复眼的小眼都由角膜(cornea)、晶体(crystalline cone)、视网膜细胞(retinula cell，或称感光细胞photoreceptor cell)和色素细胞(pigment cell)等组成(Nilsson, 1989)。然而，重叠型眼还具有一个独特的透明区(clear zone)，这在并列型眼中并不存在(Horridge, 1975)。化石记录表明，节肢动物复眼的起源可追溯到早寒武纪时期(Strausfeldetal., 2016; Parketal., 2018)。在这一时期，并列型眼已存在于古老的三叶虫中(Scholtzetal., 2019)，但这也不排除重叠型眼同时存在的可能性。昆虫并列型眼与重叠型眼之间是否存在演化关系，迄今仍存在争议，尚无定论(Meyer-Rochow, 2014)。

鳞翅目(Lepidoptera)是昆虫纲最大的植食类群(Mitteretal., 2017)，其绝大多数日出型蝶类具有并列型眼，而夜出型蛾类和少数蝶类具有重叠型眼(Horridgeetal., 1972)。目前，关于鳞翅目重叠型眼的结构特征已在夜蛾科(Noctuidae)(Meinecke, 1981; 高慰曾和郭炳群, 1983; 郭炳群, 1984, 1988)、尺蛾科(Geometridae)(Meyer-Rochow and Lau, 2008)、天蛾科(Sphingidae)(Eguchi, 1982; 高慰曾, 1986)、草螟科(Crambidae)(Belušietal., 2017)、螟蛾科(Pyralidae)(Fischer and Horstmann, 1971; Horridge and Giddings, 1971)、毒蛾科(Lymantriidae)(Lau and Meyer-Rochow, 2007)中被研究。然而，有关鳞翅目重叠型眼的研究还不充分，其他夜出型类群的复眼研究极为匮乏。灯蛾亚科(Arctiinae)是鳞翅目裳蛾科(Erebidae)中较大的一个亚科，其成虫多为夜出型昆虫，具趋光性(Zahirietal., 2012)。灯蛾亚科昆虫复眼的类型及结构特征仍未知，亟需开展研究。亲土苔蛾Manuleaaffineola属灯蛾亚科苔蛾族(Lithosiini)土苔蛾属Eilema昆虫，由于其夜出活动及具有较强趋光性的特点，故而被选择为我们的研究对象。

本研究利用光学和电子显微技术观察亲土苔蛾成虫复眼的组织和超微结构，阐明其复眼类型及结构特征，旨在填补灯蛾亚科昆虫复眼结构研究的空白，进一步扩充夜出型昆虫复眼的特征数据，以期为重叠型眼的变异趋势及复眼演化研究提供有价值的依据。

1 材料与方法

1.1 标本采集与饲养

以灯诱法于2019年6月自河南洛阳天池山(34°15′N, 111°50′E，海拔1 000 m)采集亲土苔蛾成虫活体。

1.2 样品制备

将单个活体成虫用乙醚麻醉。麻醉后的雌虫与雄虫(各5头)置于Ringer氏生理盐水(NaH2PO4∶CaCl2∶KCl∶NaHCO3∶NaCl∶dH2O=0.01 g∶0.12 g∶0.14 g∶0.2 g∶6.5 g∶1 000 mL)中，在Olympus SZ61光学显微镜下剖出完整复眼。将复眼放入2%多聚甲醛+2.5%戊二醛混合液中，于4℃下避光保存6 h以上。固定后的复眼样品经磷酸缓冲液(0.1 mol/L, pH 7.2)多次漂洗后，用四氧化锇固定液(0.1 mol/L OsO4, pH 7.2)避光固定2 h，再用相同的磷酸缓冲液漂洗多次。样品经不同浓度梯度的乙醇溶液(30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%)脱水处理，再依次用100%乙醇-LR White树脂混合物(1∶1, v/v)渗透8 h，纯LR White树脂渗透6 h和3 h。将渗透后的样品包埋于含纯LR White树脂的透明胶囊中，置于烘箱中60℃聚合48 h(陈庆霄和花保祯, 2016)。

1.3 光学显微观察

将样品块在Leica EM UC7切片机上，用玻璃刀切成厚度约2 μm的半薄切片。将半薄切片置于带水滴的载玻片上，烘干后用1%甲苯胺蓝染液染色，用蒸馏水冲洗掉染料，在连接CCD成像系统的Olympus BX-51型光学显微镜下观察并拍照。

1.4 透射电子显微观察

将样品块在Leica EM UC7切片机上，用玻璃刀切成厚度约70 nm的超薄切片。超薄切片依次用2%醋酸双氧铀染色8 min和4%柠檬酸铅染色10 min，在JEOL JEM-1230透射电子显微镜下观察并拍照。

2 结果

研究结果表明，亲土苔蛾成虫复眼在雄蛾与雌蛾之间不存在明显的结构差异。因此，为方便描述，我们统一选择雌蛾的复眼进行描述。

2.1 亲土苔蛾成虫复眼组织结构

亲土苔蛾成虫复眼的小眼由角膜、晶体、视网膜细胞、初级色素细胞(primary pigment cell)、次级色素细胞(secondary pigment cell)和基膜(basement membrane)等构成。在复眼中，所有小眼的晶体与视杆(rhabdom)并不相接，两者之间存在一个透明区，厚度约110 μm(图1: A)。每个小眼的透明区由6个次级色素细胞组成(图1: B)。

图1 亲土苔蛾雌蛾复眼组织结构光学显微镜观察

2.2 亲土苔蛾成虫复眼超微结构

小眼最外层为外凸的角膜，厚度约16 μm，分层。角膜远端大部分区域的片层较厚，排列疏松，向外凸起，而近端部分的片层呈水平状紧密堆叠。角膜的外表面覆盖微小的乳头状凸起，称为角膜突(corneal nipples)，高约300 nm(图2: A)。

角膜下方是一个长圆锥形晶体，高约50 μm(图1: A)。晶体为真晶体(eucone)类型，由4个晶锥细胞(cone cells)及其细胞内分泌物组成。晶锥细胞的细胞核位于晶体的最远端部分(图2: A)。在细胞核下方，晶锥细胞的分泌颗粒并不均匀分布，外部分布稀少，形成一圈电子较透明的区域，宽约800 nm；而内部分布致密，呈电子不透明状(图2: B, C)。4个晶锥细胞的细胞质(除分泌颗粒外)分别从核区沿颗粒分布区的外缘向下延伸，在晶体近端聚集，形成一个细长的晶体束(crystalline tract)，长约15 μm(图2: D)。晶体束内含有致密的纤维状微管(microtubules)。

晶体被一对初级色素细胞围绕。初级色素细胞的最远端与角膜内表面相接，包含微管(图2: B)。2个初级色素细胞沿晶体外缘一直向下延伸至晶体束远端，并未包裹晶体束(图2: C, D)。初级色素细胞外侧分布着一纵列球状电子致密的色素颗粒，直径0.4～0.6 μm(图2: C)。初级色素细胞的细胞核位于晶体的中部水平(图3: A)。在晶体近端，初级色素细胞包含电子致密的细小颗粒状物质，它们聚集在晶体周围(图2: D; 图3: B)。

6个次级色素细胞围绕着一个小眼(图1: B)。每个次级色素细胞填充在相邻小眼之间，从角膜内表面一直延伸至基膜处。在晶体远端水平，次级色素细胞位于相邻初级色素细胞外侧狭窄的空间中(图2: A, C)。在晶体近端水平，次级色素细胞膨大，填充在晶体束与视网膜细胞之间，形成透明区(图1: A)。透明区中的次级色素细胞分布着电子致密的球状色素颗粒，直径0.4～0.6 μm(图2: D; 图3: C)。次级色素细胞的细胞核位于晶体束的末端水平，在细胞核的周围聚集着线粒体(图3: D)。

图2 亲土苔蛾雌蛾小眼远端纵切透射电镜观察

图3 亲土苔蛾雌蛾小眼远端横切透射电镜观察

小眼的视网膜细胞从晶体束末端穿过透明区一直向下延伸(图4: A)。视网膜细胞的最远端部分与晶体束末端相接(图4: B)。从横切面上看，7个视网膜细胞首先出现在晶体束末端外缘(图4: C)。这些视网膜细胞在向下延伸的过程中可能出现了一定程度的扭转，以至于在纵切面上呈现出视网膜细胞截断的现象(图4: A)。在晶体束下方，7个视网膜细胞围绕小眼的中心轴呈辐射状排列，它们的内侧细胞膜没有特化成微绒毛，故不形成视杆。这些视网膜细胞的细胞质中分布着粗面内质网，在靠近小眼中心轴处聚集着大小、形状不一的电子透明囊泡(图4: D)。向近端，视网膜细胞的细胞核在距晶体束末端约18 μm开始出现(图4: A)，在细胞核的周围还分布着光面内质网(图4: E)。

图4 亲土苔蛾雌蛾小眼视网膜细胞远端透射电镜观察

在视网膜细胞的细胞核聚集区域下方，视网膜细胞急剧变细，形成细杆状的视网膜细胞束，穿过具球状色素颗粒的透明区(图5: A)。在这一区域可见7个视网膜细胞仍没有形成视杆(图5: B)。再向近端，距细胞核聚集区约70 μm处，视网膜细胞束膨大，相邻细胞束之间的透明区范围缩小，且不具有色素颗粒(图5: C)。在这一水平，每个视网膜细胞的细胞膜特化成密集堆叠的指状微绒毛，形成视小杆(rhabdomere)。7个视网膜细胞的视小杆聚集在一起形成视杆(图5: D)。

图5 亲土苔蛾雌蛾小眼透明区横切透射电镜观察

图6 亲土苔蛾雌蛾小眼视网膜细胞近端横切透射电镜观察

从距晶体束末端约120 μm向下，视网膜细胞的视小杆微绒毛排列整齐，并在小眼中心轴聚集，形成中心闭合的视杆，长度约80 μm。在复眼的大部分区域，小眼视杆呈分支状，多为6个分支(图6: A)。这种分支状的视杆由7个视网膜细胞形成，每个视网膜细胞近似三角形，其视小杆呈V形，微绒毛整齐堆叠在三角形细胞的两个长边上(图6: B)。然而，在复眼的背侧边缘，一小部分小眼的视杆近似矩形，无明显分支(图6: C)。这些矩形视杆也由7个视网膜细胞的视小杆组成，其中位于矩形短边的两个视网膜细胞的视小杆呈三角形，其微绒毛平行排列，两个矩形长边分别有3个和2个视网膜细胞，其视小杆微绒毛也相互平行，而分别位于矩形长边和短边的视小杆微绒毛相互垂直(图6: D)。在这一区域，视网膜细胞的细胞质中包含线粒体(mitochondria)以及多泡体(multivesicular bodies)。透明区终止于这一区域的远端，形成透明区的次级色素细胞骤缩呈近小三角形，填充在相邻视网膜细胞束之间。在相邻视网膜细胞束之间还填充着圆形或线形微气管(tracheoles)。

图7 亲土苔蛾雌蛾小眼基部视网膜细胞横切透射电镜观察

当小眼视杆继续向近端延伸，一个新的视网膜细胞开始出现，因其仅存在于小眼的基部，故称为基部视网膜细胞(basal retinula cell)。这个基部视网膜细胞首先出现在小眼视网膜细胞束的中央，被其余7个视网膜细胞完全包裹。基部视网膜细胞的视小杆沿细胞外围分布，呈圆环状，而其余的7个视网膜细胞的视小杆围绕着这个圆环形的基部视网膜细胞视小杆，此时的视杆不再呈现中心闭合状(图7: A)。再向近端，基部视网膜细胞向外扩张，在外围视网膜细胞一侧开口。基部视网膜细胞的视小杆不再闭合，而是平行排列于细胞的两侧(图7: B)。外围7个视网膜细胞逐渐被基部视网膜细胞隔开，位于基部视网膜细胞的两侧。在这一水平上，所有视网膜细胞的细胞质中都包含大量线粒体，其中基部视网膜细胞中还具有多泡体(图7: C)。视网膜细胞束之间填充着具内脊的微气管(图7: D)。

图8 亲土苔蛾雌蛾小眼基膜透射电镜观察

基膜位于小眼的基部，厚度约1 μm，将小眼的感光区与视叶隔开(图8: A)。小眼的视杆终止于基膜上方约25 μm处。视杆的末端仅由基部视网膜细胞两侧的视小杆形成，其余7个视网膜细胞在外围转化成神经轴突(axons)(图8: B)。当基部视网膜细胞的视小杆消失后，其细胞质中出现电子致密的球状色素颗粒，直径约0.3～0.5 μm，而外围7个视网膜细胞的轴突被微气管分隔开(图8: C)。基部视网膜细胞的细胞核位于色素颗粒分布区域的下方(图8: D)。在基膜上方，次级色素细胞膨大，包含色素颗粒。基部视网膜细胞转化成轴突，与其余7个视网膜细胞的轴突一起穿过基膜上的小孔进入视叶(图8: E)。在基膜下方，每个小眼的8个视网膜细胞的轴突聚集成束(图8: F)。

3 讨论

基于组织与超微结构研究发现，亲土苔蛾成虫复眼的小眼由1个分层的角膜、1个真晶体、8个视网膜细胞、2个初级色素细胞及6个次级色素细胞等组成，且在晶体与视杆之间还存在一个明显的透明区，这与昆虫典型的重叠型复眼结构基本一致(Nilsson, 1989)。

透明区是夜出昆虫复眼特有的结构，常由次级色素细胞的透明胞质构成(Horridge, 1975)。在亲土苔蛾成虫复眼中，成簇的小眼视网膜细胞穿过透明区，与晶体束相接。透明区中的视网膜细胞具细胞核及多种细胞器，但并不形成视杆。这种情况也存在于毒蛾科(Lau and Meyer-Rochow, 2007)和尺蛾科(Meyer-Rochow and Lau, 2008)中。在夜蛾科的非洲粘虫Spodopteraexempta中，穿过透明区的视网膜细胞束仅在与晶体相接的最远端部分具有少量的视杆微绒毛，其下的细胞束都不形成视杆(Meinecke, 1981)。然而，在草螟科(Belušietal., 2017)与螟蛾科(Fischer and Horstmann, 1971; Horridge and Giddings, 1971)中，穿过透明区的视网膜细胞束具有一个中心融合的细长视杆，与晶体末端相接。由此可见，在不同鳞翅目类群的重叠型眼中，透明区内视网膜细胞的视杆形成情况存在一定的趋同和多样化变化的特点。

在亲土苔蛾复眼中，小眼具8个视网膜细胞，其中1个视网膜细胞较短，仅位于小眼基部。这种“7+1”式的视网膜细胞排列方式既存在于原始的昆虫中也存在于与昆虫纲互为姊妹群的甲壳纲中，故而被认为是祖征(Paulus, 1979, 2000)。此外，“7+1”式的视网膜细胞排列方式也存在于鳞翅目微蛾科(Nepticulidae)(Honkanen and Meyer-Rochow, 2009; Fischeretal., 2012)和夜蛾科(Meinecke, 1981; 郭炳群, 1984, 1988)中。毒蛾科昆虫Orgyiaantiqua具有9个视网膜细胞，排列成“8+1”式(Lau and Meyer-Rochow, 2007)，这与天蛾科(Eguchi, 1982)和草螟科昆虫Acentriaephemerella的一致(Lauetal., 2007)。然而，其他一些螟蛾总科昆虫的小眼视网膜细胞数目增加到11～13个(Fischer and Horstmann, 1971; Horridge and Giddings, 1971; Stone and Koopowitz, 1976; Belušietal., 2017)。尺蛾科昆虫Operophterabrumata的小眼视网膜细胞数目多达15个，呈“14+1”式分布(Meyer-Rochow and Lau, 2008)。蝶类的小眼视网膜细胞数目通常为9个，呈“8+1”式(Kolb, 1977; Ribi, 1978; Arikawa, 1999; Wernetetal., 2015)。由此可见，在鳞翅目中，相比于蝶类，蛾类的小眼视网膜细胞数目可能更加多样化。

亲土苔蛾的小眼视杆分为两种类型：复眼背缘区域的视杆横截面近似矩形，而其余大部分区域的视杆截面呈多分支状。这种视杆的区域性形态差异也在草螟科欧洲玉米螟Ostrinianubilalis(Belušietal., 2017)以及夜蛾科棉铃虫Heliothisarmigera(郭炳群, 1988)、粘虫Leucaniaseparata(郭炳群, 1984)和非洲粘虫S.exempta(Meinecke, 1981)中被报道。与分支状视杆不同，矩形视杆内的视小杆微绒毛相互垂直排列，被认为是昆虫具有偏振敏感能力的主要指示特征(Labhart and Meyer, 1999)。虽然草螟科昆虫A.ephemerella的小眼视杆在整个复眼中没有形态差异，但复眼背缘区视杆要明显比其他区域的视杆短得多(Lauetal., 2007)。这种缩短的背缘区视杆也有助于增加昆虫的偏振敏感性(Nilssonetal., 1987)。相反，一些蝶类复眼的去偏振化可能是由于其较长的视杆所致(Nilssonetal., 1984, 1988)。除视杆的长度及微绒毛的排列方式外，昆虫复眼的偏振性还与视杆的构象(Wehneretal., 1975)以及屈光系统(Meyer and Labhart, 1981; Ukhanovetal., 1996)有关。由此我们推测，多种因素的结构特征很有可能促使偏振敏感性广泛存在于许多昆虫中，然而相关复眼的结构及功能研究还相当匮乏，亟需得到更多的关注。

在本研究中，亲土苔蛾是在光适应下进行麻醉和解剖的，故而我们的研究数据显示的是光适应下的重叠型复眼结构特征。在许多夜出型昆虫的重叠型复眼中，光适应下的复眼次级色素细胞的色素颗粒常纵向迁移进入透明区，用于吸收更多较强的光线，由此将进入视杆的光强减少了3～4个量级(Warrant and McIntyre, 1996)。这种色素的纵向迁移也在亲土苔蛾的光适应复眼中被发现。然而，在具有重叠型复眼的日出型弄蝶科(Hesperiidae)(Horridgeetal., 1972)和虎蛾科(Agaristidae)(Horridgeetal., 1977, 1983)中，光适应下的次级色素细胞的色素颗粒并不发生纵向迁移进入透明区，而是维持一个具有无色素的透明区并提供仅约0.6个量级的光衰竭(Warrant and McIntyre, 1996)。由此我们推测，光适应下色素是否纵向迁移进入透明区很可能与昆虫的昼夜节律密切相关。夜出型昆虫重叠型复眼在光/暗适应下色素迁移的动力学机制仍知之甚少，需要更多的功能学研究。

致谢感谢东北林业大学林学院韩辉林副研究员对标本鉴定的帮助；感谢西北农林科技大学电镜实验平台何晓华实验师和郭付振高级实验师在技术上的支持。