HefABC 系统与幽门螺杆菌耐药关系研究进展

何春萌 黄 瑛

复旦大学附属儿科医院（上海 201102）

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H.pylori）是微氧条件下生存的革兰阴性螺杆菌[1]，生长条件苛刻。由Giulio Bizzozero最早发现，Warren与Marshall首先分离培养成功，并证明其致病性。H.pylori在世界范围内感染率约50%[1]。研究表明，我国H.pylori感染率为56.22%[2]，中国自然人群儿童及青少年H.pylori总感染率达29%[3]。H.pylori感染可导致慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关性淋巴瘤及胃癌。1994年世界卫生组织将H.pylori列为I 类致癌因子[4]。近年研究表明，H.pylori感染与消化系统中慢性肝病、上消化道出血，高氨血症、肝性脑病等疾病以及内分泌、造血、心血管系统疾病相关联[5]。

外排泵是一类将药物自细菌胞浆内泵出胞外的膜转运蛋白，通过降低胞浆内药物浓度从而使细菌具有耐药性。目前抗菌药物耐药相关外排泵可分为五大家族：主要易化子 (major facilitation superfamily，MFS) 超家族、多药和毒性化合物外排（multidrug and toxic compound extrusion，MATE）家族、ATP结合盒（ATP-binding cassette，ABC）超家族、耐药结节分化（resistance nodulation-cell division，RND）家族和小多重耐药（small multidrug resistance，SMR）家族[6]。而Hef系统即为H.pylori细胞膜上RND外排泵。2000年由Bina等[7]于H.pylori11 637菌株中首先发现，并命名为hefABC、hefDEF 和hefGHI，为H.pylori26695 ORFs 0605-0607、0971-0969、1327-1329和H.pyloriJ99 ORFs 0552-0554、0905-0903、1246-1249。其中hefGHI只在体内具有活性，hefABC及hefDEF在体内、外均具有活性。多项实验证明，Hef 系统与AcrABTolC系统具有同源性。hefA、hefD、hefG编码TolC样外膜通道蛋白，hefB、hefE、hefH编码AcrA样膜融合蛋白，hefC、hefF、hefI 编码AcrB 样内膜主动转运蛋白[8-12]。

现有研究多集中于针对HefABC 系统进行研究，其余研究较少。本文就HefABC系统与H.pylori耐药性关系研究进展进行综述。

1 我国H.pylori耐药现状

随着抗生素的使用增多，H.pylori的耐药率逐渐增高，且出现大量双重、多重耐药菌株。现阶段国内临床使用三联或四联疗法治疗H.pylori感染，即质子泵抑制剂（proton pump inhibitor，PPI）和两种抗生素联合或PPI、铋剂、两种抗生素，根除率为80%。常用抗生素为硝基咪唑类甲硝唑（metronidazole）、大环内酯类克拉霉素（clarithromycin）、β-内酰胺类阿莫西林（amoxicillin）和四环素类[13]。H.pylori基因突变率很高[14]，且特定的点突变提高了H.pylori对多种抗生素的耐药水平[15-16]。国内2012－2014 年浙江丽水地区甲硝唑与克拉霉素及甲硝唑与左氧氟沙星交叉耐药率均＞15%[17]；2011－2014年青岛地区双重及多重耐药率为29.9%，克拉霉素＋左氧氟沙星耐药率为10.4%，左氧氟沙星＋甲硝唑耐药率最低，为3.0%[18]；北京地区双重耐药率为29.6%，三重及以上耐药率为33.4%[19]。以上实验结果均证明我国现阶段H.pylori感染双重及多重耐药率高，值得重视。

2 HefABC外排泵与H.pylori耐药关系

2.1 hefABC基因表达与H.pylori耐药性关系

现有研究多集中于hef基因与单种药物耐药的相关性研究。在对H.pylori多重耐药性与hef 基因相关性进行的研究中，研究者通过氯霉素体外诱导临床分离株产生耐药性，测定诱导后菌株对甲硝唑、四环素、琥乙红霉素、环丙沙星和青霉素G 的耐药性,从而筛选出多重耐药株，并与临床分离株对比研究，结果发现，多重耐药菌hefA mRNA 表达水平显著高于敏感株；再构建hefA基因敲除株，测定基因敲除前后菌株对10 种抗生素的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC），结果显示，基因敲除株总体对4 种抗生素的MIC 显著减小，差异有统计学意义；且通过PCR 扩增发现，所有临床分离株均存在hefA 及hefC 基因，无hefABC 系统缺失[20]。这项研究表明，hefA基因在H.pylori多重耐药机制中起重要作用，HefABC系统在H.pylori中普遍存在。

还有研究者对特定H.pylori野生株构建了hefC、hefF、hefI3个等位基因突变株，测试突变株与野生株对12种抗生素的MIC值，发现hefC突变株70%抗生素MIC值下降，其中克林霉素、四环素、头孢噻肟MIC值出现了8～16 倍的减低，而hefF与hefI基因突变前后细菌耐药性无明显差异[8]。更进一步证实hefABC系统与H.pylori耐药性有关。

另外，通过筛选临床157例患者的H.pylori菌株，对其针对不同抗生素MIC 值测定，发现15 株多重耐药菌株；而通过测定hefA及gyrB（一种内源性基因）表达比值，发现耐药菌株hefA表达均显著高于单药耐药或抗生素敏感菌株[21]。

2.2 与甲硝唑耐药性关系

研究发现，暴露于5 种甲硝唑浓度下存活的H.pyloritolC同源基因表达，发现hefA基因表达与甲硝唑浓度增加具有一致性[10]。

研究证明，rdx基因、frxA基因表达减低可导致H.pylori甲硝唑耐药性增加[22-23]。研究发现，在亚抑制浓度甲硝唑中培养H.pylori敏感株，诱导其子株产生甲硝唑耐药性，产生耐药性菌株hefA基因表达均大幅增高，而其中6株Rdx酶活性并无下降，5株耐药性可以被外排泵抑制剂（efflux pump inhibitor，EPI）PAβN抑制。Rdx酶活性减低菌株耐药性则不可被PAβN抑制。由此可以认为，甲硝唑耐药性产生分为两步：①hefA的表达增多；②Rdx酶活性降低。且hefA基因表达增多是H.pylori产生耐药性的第一步[11]。

另有研究者收集53种H.pylori临床菌株，21种具有甲硝唑耐药性，其中17种发现rdxA、frxA基因突变，3种含完整rdxA、frxA基因菌株均有hefA基因表达，而在敲除hefA后，MIC值显著下降，丧失耐药性[24]。提示hefA基因表达可使H.pylori产生甲硝唑耐药性，且与rdxA、frxA基因无关。

2.3 与克拉霉素耐药性关系

研究者通过RT-PCR 对15 个克拉霉素耐药株的hefABC、hefDEF、hefGIH基因表达的检测发现，hefABC系统基因在每个菌株中均有表达，推测该系统与克拉霉素耐药性关联密切[25]。

对临床分离的12 株克拉霉素耐药H.pylori菌株的基因测序显示，12 株耐药菌hefABC 均存在不同类型的基因突变，且突变点位较敏感菌株明显增多。其中hefA基因存在4 种突变类型，hefB基因存在3 种突变类型，hefC基因存在2种突变类型。hefABC 基因突变可能导致该基因表达增多[26]。

2.4 与阿莫西林耐药性关系

体外培养含hefC基因特定H.pylori菌株26695，将对阿莫西林MIC值＞0.5 mg/L的菌株为IS1～IS5共5例，自IS1～IS5菌株，MIC值逐渐增大，耐药性提高。分析基因序列与26695 序列对比显示，IS 1～IS 5 均存在hefC基因突变，且hefC基因中D131E和L378F位点同时突变的菌株耐药性上升16 倍，仅有L 378 F 位点突变耐药性上升8倍，仅有D131E位点突变耐药性无改变。说明D131E及L378位点突变可导致hefABC基因表达增多[27]。

2.5 与其他抗菌药物耐药性关系

除抗生素外，还发现胆固醇能增加H.pylori对胆酸盐和阳离子甾体化合物（ceragenins，一种新型的抗菌药物类）的耐药性[28]。而在存在胆固醇的培养基中，当同时伴有胆酸盐或ceragenins 时，hefC表达明显增多，提示HefABC 系统对新型抗菌药物也存在抑制作用，这也符合RND系统底物多样的特点。

2.6 与细菌生物膜形成相关性

生物膜是单个细菌繁殖形成的菌落，具有立体结构，可具有与浮游细胞不同的表型及生化特性[29-30]。生物膜的形成可增加致病菌的耐药性[31]。研究发现，hef基因可促进生物膜形成。

在对H.pylori生物膜形成与克拉霉素敏感性及耐药基因突变之间关系的研究中发现，H.pylori外排泵基因HP605、HP971、HP1327或HP1489在生物膜株中的表达明显高于浮游株，且生物膜株多药联合用药时耐药性显著高于浮游株[32]。

利用qPCR技术同步监测多种临床耐药株H.pylori生物膜株及浮游株hefA和HP1165基因表达量，结果显示，H.pylori生物膜株耐药性较浮游株明显增高，且hefA及HP1165表达也随之增高[33]。hefA及HP1165表达与人β防卫素（hβDs）释放具有协同作用。hβDs可杀灭H.pylori，抑制H.pylori生长，但长期hβDs刺激可使得H.pylori躲避免疫系统攻击，而hβDs的表达可在个体内发挥促进生物膜形成的作用[34]。

3 外排泵抑制剂研究进展

根据现有研究已知HefABC家族外排泵在H.pylori多重耐药性产生中具有重要地位，而针对RND 系统的EPIs 是解决H.pylori耐药性的重要途径。外排泵抑制剂主要有以下3 类：①能量阻断剂，如羰基氰化物间氯苯腙（carbanyl cyanide m-chlorophenylhydrazone，CCCP），其通过质子动力解耦联，从而使外排泵失活；②竞争性抑制剂，竞争性结合底物结合位点，从而抑制细菌外排泵活性，如 Phe-Arg-β-naphthylamide（PaβN）；③非竞争性抑制剂，作用于外排泵本身，使其构象发生变化而失活，如格罗泊霉素。

研究显示，CCCP 降低H.pylori多重耐药株氯霉素、琥乙红霉素、头孢噻肟、头孢曲松和四环素的MIC值[35]。H.pylori耐药菌对克拉霉素的MIC 值与随着PAβN剂量存在一致性[12]。但以上两项研究均显示，EPIs对敏感株作用不大。

由于对EPIs的药理研究尚不全面，EPIs相关药物尚未用于临床。

综上，现对于不同革兰阴性菌RND 系统与细菌多重耐药性研究关系较多，近期RND 系统研究多集中于铜绿假单胞菌多重耐药机制与RND 系统相关性探索。对于H.pylori多重耐药性研究较少，且处于初步阶段。多项研究均显示，HefABC系统表达可导致H.pylori对不同药物耐药性的增强。但针对多药耐药仍需进一步研究。另有研究表明，RND系统除外排药物外，也可与致病毒素外排相关[36]。现有研究仅局限于hef基因与H.pylori耐药性之间的联系，而并没有对于外排毒力蛋白，如空泡细胞毒素A（vacuolar cytotoxin A，VacA）的研究。现有针对HefABC家族与H.pylori耐药性研究仍较少，对于其机制研究不够系统，仍有许多不足及待发现之处，有待进一步探索，以便发掘HefABC系统与H.pylori耐药的关系。