粒细胞集落刺激因子在新生儿缺氧缺血性脑病中的脑保护作用研究进展

许梦杰 杜 江 综述 王 斌 审校

1.南方医科大学珠江医院儿科中心（广东广州 510280）；2.广州市炎症与免疫性疾病重点实验室（广东广州 510280）

缺氧缺血性脑病（hypoxic ischemic encephalopathy，HIE）是指大脑的血液和氧气供应不足而导致的严重脑损伤。尽管胎儿监测和新生儿重症监护医学不断改进，围产期HIE仍然是新生儿死亡和永久性神经系统后遗症的重要原因，如脑瘫，智力低下，学习障碍和癫痫等[1]。目前HIE的主要临床治疗包括，抗惊厥药、低温治疗以及液体和电解质管理，但疗效并不明确。由于目前新生儿HIE发病率仍较高，因此需要寻求更有效的治疗方法[2-3]。

粒细胞集落刺激因子（granulocyte colonystimulating factor，G-CSF）是一种骨髓干细胞动员剂，主要作用于中性粒细胞系造血细胞的增殖、分化和活化，临床主要用于预防和治疗肿瘤放疗或化疗后引起的白细胞减少症[4]。越来越多的证据表明，G-CSF 在中枢神经系统有着重要的神经保护功能，G-CSF介导的脑保护作用的潜在机制是抗细胞凋亡，诱导内源性神经与血管形成的再生以及抗炎作用等[5]。但其确切的神经保护机制尚不明确。本文综述G-CSF 在治疗新生儿缺氧缺血性脑病中的信号传导通路、脑保护机制，以及G-CSF联合其他药物治疗HIE的方法。

1 G-CSF脑保护作用的 信号传导通路

G-CSF 通过结合特定的G-CSF 受体（G-CSF receptor，G-CSFR）而产生相应的效应。G-CSFR 是一种I 型跨膜蛋白，其胞外结构由免疫球蛋白样结构域、细胞因子受体同源结构域和三个纤连蛋白结构域的复合物组成，胞内结构由三个氨基酸序列组成[6]。G-CSFR不仅存在于多种造血细胞，如嗜中性粒细胞，单核细胞和血小板上，还存在于非造血细胞，如内皮细胞，神经元细胞，神经胶质细胞，室管膜细胞和脉络丛细胞等细胞中。在中枢神经系统中，G-CSFR 广泛但不均匀地分布于海马CA 3 区、齿状回、嗅球、大脑皮层的锥体细胞、小脑、脑干的浦肯野细胞、腹侧外侧核以及内侧和外侧丘脑[7-8]。成年人大脑缺血损伤后，G-CSFR 在神经元和神经胶质细胞的表达上调，而新生儿在缺氧缺血损伤后大脑同样有G-CSFR的表达，且表达量明显高于正常大脑[9]。当G-CSF与G-CSFR 结合后，主要是通过三条信号通路来发挥神经保护作用的：两面神激酶/信号转导与转录激活因子（Janus Kinase/ Signal transducers and activators of transcription，JAK/STAT）、Ras/丝裂原活化蛋白激酶（Ras/Mitogen-activated protein kinase，Ras/MAPK）、磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（Phosphatidylinositol 3-kinase/ Protein Kinase B，PI3K/Akt）[10]。

1.1 JAK/STAT通路

当G-CSF与受体结合后，活化G-CSFR引发JAK激酶的磷酸化并随后募集STATs 等转录因子，进一步影响细胞核内的基因表达。STATs 家族由STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6组成，其中STAT1、STAT3、STAT5参与G-CSF诱导的细胞增殖、分化及抗细胞凋亡作用[11]。研究发现，局灶性脑缺血大鼠在给予G-CSF治疗后，梗死半影区神经元上的STAT3表达上调，STAT3通过激活bcl-2来介导抗细胞凋亡功能，除外STAT3 表达上调还可增加脑源性神经营养因子或碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）为神经元提供营养支持[12]。

1.2 Ras/MAPK通路

MAPK 可分为4 个亚族：ERK、p 38、JNK 和ERK5。G-CSF与受体结合后可激活Ras蛋白，进而活化神经元上的ERK，其中ERK 1/2 的短暂激活以及ERK5强烈而持续的激活在抗神经细胞凋亡中发挥作用[13]。实验中发现，G-CSF通过一系列细胞内途径减弱高糖、游离脂肪酸和低氧引起的人脑血管内皮细胞损伤，其中包括调节ERK1/2的激活及JNK和p38的失活[14]。还有实验证明，ERK 1 和ERK 2 为神经营养因子，而JNK3 及ERK5 则有提高神经元存活率的作用[15-16]。

1.3 PI3K/Akt通路

研究发现，G-CSF 在抗神经元细胞凋亡作用中，PI 3K/Akt 途径起到了最显著的作用[13]。在动物实验中发现，G-CSF 与受体结合后通过PI 3K/Akt 途径抑制糖原合成激酶3β（Glycogen synthesis kinase-3β，GSK-3 β）活性来减弱新生SD 大鼠缺血缺氧后的神经细胞凋亡、神经炎症和血脑屏障的破坏[17-18]。研究发现，G-CSF 在脑出血后通过增强PI 3K/Akt 信号通路活性，促进B 淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）基因和血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）表达，减少神经细胞凋亡，增加血容量，改善脑出血后神经功能和促进血管生成[19]。

2 G-CSF 的神经保护作用机制

2.1 抗凋亡

HIE 神经元受损的主要机制之一就是细胞凋亡，而成熟度低的大脑在缺血后则会出现更严重的细胞凋亡[20]。在新生大鼠实验中，G-CSF 与受体结合后，通过多种途径抑制细胞凋亡诱发的程序性细胞死亡，从而保护神经元[9,18,21]。G-CSF通过JAK/STAT3信号传导途径上调Pim-1基因表达，从而增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平，抑制促凋亡蛋白Bax调节细胞色素c 从线粒体释放，进一步抑制凋亡执行蛋白半胱天冬酶3（Caspase 3）的激活，从而抑制细胞凋亡[9]。研究发现，G-CSF 通过PI 3K/Akt 途径抑制下游GSK-3β表达水平，从而减少凋亡神经细胞数目及大脑梗塞面积[18,21]。

2.2 抗炎

在脑损伤时诱发炎症反应已被大家熟知，包括中性粒细胞浸润，小胶质细胞活化和循环单核细胞数量的增加。在缺血期间，炎症因子，如IL-1、IL-6、TNF-α、TGF-β和趋化因子由多种活化细胞产生，包括内皮细胞，小胶质细胞，神经元，血小板，白细胞和成纤维细胞[22-23]。缺血缺氧新生大鼠给予G-CSF治疗后，炎症因子核因子κB激酶抑制剂（Inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，IKKβ），NF-κB，TNF-α，IL-1 β 和IL-12 下调，而抗炎细胞因子IL-10 表达增强[17]。在早产羊HIE模型中发现，G-CSF治疗可减少脑部炎症，明显降低小胶质细胞的高度特异性标志物离子化钙结合衔接分子1（Ionized calcium binding adapter molecule 1，IBA-1）的水平，即说明G-CSF抑制了小胶质细胞增殖来减少脑部炎症反应[24]。

2.3 稳定血脑屏障

血脑屏障是一种高度专化的内皮结构，可作为生化屏障，将脑组织与血液中循环的物质分开，并维持脑微环境的稳态。由于新生儿血脑屏障发育尚未成熟，当发生缺血缺氧时极易引起血脑屏障连接复合体的破坏，可进一步加重脑水肿损伤，这是HIE 脑损伤和脑组织损伤的重要原因之一[25]。在新生大鼠HIE模型中，G-CSF 能够通过降低β-连环蛋白磷酸化和通过G-CSFR/PI3K/Akt/GSK-3β途径的p120-连环蛋白磷酸化来减少血脑屏障的破坏[17]。在同一模型中还发现，给予G-CSF 治疗后，HIE 新生大鼠脑水含量下降，说明G-CSF保持血脑屏障的完整性的作用[26]。

2.4 抑制下丘脑-垂体-肾上腺（Hypothalamuspituitary-adrenal gland，HPA）轴活性

脑损伤包括胎儿在宫内的缺氧会上调HPA 轴的活性导致基础血浆皮质醇水平升高，而出生后若早期降低HPA 轴活性可以预防颅内出血等与缺血缺氧性脑损伤相关的颅脑神经损伤[27]。在HIE新生大鼠中发现，G-CSF通过激活JAK2/PI3K/PDE3B途径降解细胞内cAMP，从而抑制HPA轴活性来降低肾上腺皮质酮合成，进一步减小脑梗死面积，逆转体重减轻，减少脑水含量，减少神经细胞凋亡等来实现对神经的保护作用[26,28]。

2.5 促进神经血管再生

在脑组织缺氧缺血时，VEGF 与受体结合后可刺激血管与神经再生实现对脑组织保护作用。当脑组织缺氧缺血时，氧分压及二氧化碳分压的失衡刺激VEGF的分泌增加，进一步诱导血管生成，提高血流灌注，改善氧合，减轻脑损伤及神经细胞凋亡，促进神经发生[29-30]。在急性缺血性脑损伤大鼠中，G-CSF治疗组的VEGF表达强度显著高于对照组，提示G-CSF在缺氧缺血性脑损伤中可能通过提高VEGF的表达水平实现血管生成及神经再生的保护作用[31]。

2.6 动员造血干细胞

G-CSF是一种强大的骨髓干细胞动员剂，可刺激自体骨髓干细胞的增殖，并动员骨髓干细胞从骨髓进入外周血。研究证明，G-CSF可直接动员骨髓干细胞，促使外周血中的大量骨髓干细胞向脑缺血区迁移，形成内源性骨髓干细胞移植，使大脑梗死灶周围的CD 34+细胞明显增多，大脑梗死灶减小，神经功能修复能力增强，动物生存率提高[32-33]。在HIE早产羊模型中，早产羊接受G-CSF治疗后外周血中CD34+细胞在白细胞中所占比例明显提高，治疗组在神经元和神经胶质细胞再生，增强髓鞘再生能力方面优于非治疗组。这一结果也说明G-CSF在HIE中发挥神经保护作用与动员造血干细胞密切相关[34]。

3 联合治疗

HIE 在临床上是一种需要综合治疗的疾病，目前研究者也在不断探索G-CSF与其他药物联合治疗HIE的方法，以更好促进受损神经的恢复。在新生大鼠动物试验中，G-CSF与抗中性粒细胞胞抗体联合治疗可显著减少大脑梗塞体积，改善神经功能且能同时减少中性粒细胞计数，提高用药的安全性[35]。G-CSF和促红细胞生成素的组合疗法不仅协同改善行为功能，而且还促进神经发生和血管生成，同时降低星形胶质细胞反应，减轻HIE新生大鼠的脑损伤[36]。在HIE大鼠模型中，G-CSF与干细胞因子联合治疗不仅可以在预防脑萎缩方面起到协同作用，还可以显著改善神经功能[37]。上述研究显示，G-CSF与其他药物的联合治疗在HIE治疗上有很好的发展前景，不仅可以增强神经保护作用，还可以提高用药的安全性，但如何选用最好的治疗组合仍需不断地进行探索。

综上，在动物模型中，G-CSF 被证实可通过抗凋亡、抗炎、稳定血脑屏障、抑制HPA轴活性、促进神经血管再生及动员造血干细胞等多种机制，在HIE中发挥神经保护作用。近年来，G-CSF 在治疗成人神经损伤性疾病上已进行I期、II期临床试验，在新生儿HIE治疗及改善预后等方面可能也具有广阔的前景。但在G-CSF在真正运用到HIE临床治疗前，仍需进一步探讨其作用机制、最佳剂量、治疗时间窗及不良反应等。