ACE2蛋白结构和功能生物信息学分析

于 欣，于美玲，马全萍，戴亚东，杨 震

肾素-血管紧张素系统(RAS)是人体内重要的体液调节系统，在心血管疾病的发生发展及转归过程中发挥重要作用。在2000年，两个独立的研究小组从心脏移植受体的外植心脏制备的人心脏左心室cDNA文库和人淋巴瘤cDNA文库中发现了血管紧张素转换酶(ACE)的同源物ACE2[1-2]。目前研究[3]表明，ACE2不仅和动脉粥样硬化、高血压有关，也与心律失常有关。笔者利用生物信息学一些软件分析ACE2不同特点，为研究其在临床常见疾病如心血管疾病发生与发展、治疗提供了思路。

1 资料与方法

1.1 数据获取：在数据库https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/检索从而获得人的ACE2蛋白序列(Genbank：BAB40370.1)。

1.2 研究方法：①采用在线获取生物信息学软件protparam，用该软件分析ACE2蛋白的物理、化学特性；获得在线软件ProtScale并用其分析ACE2蛋白疏水性。②利用软件SignalP 4.0分析ACE2信号肽。首先输入前70个氨基酸，利用神经网络模型NN和隐马尔可夫模型HMM进行预测，一般包括三个值：S-score、C-score和Y-score。S-score：每个氨基酸对应1个S值，在结果显示的图标中有一个曲线显示S值的变化趋势，利用S平均值来判断分泌蛋白：若S平均值>0.5，则为分泌蛋白，且存在信号肽。C-score：剪切位点的值，在剪切位点处的C值是最高的。每个氨基酸会有一个C值，在剪切位点处的C值是最高的。Y-score：Y值是综合考虑S值和C值的一个参数，其比单独考虑C值要精准，因为在一系列中C值可能有不止一个较高的位点，但是剪切位点只有一个；此时的剪切位点就由Y-max值来推测，S值是陡峭的位值和具有高C值的位点，即剪切点。通过Y最大值来判断信号肽剪切位点。③用软件TMHMM 2.0Sever对ACE2跨膜结构相关生物信息特点进行预测。④利用TargetP、PSORTⅡ软件等全面综合分析其亚细胞定位；ACE2入在线亚细胞定位生物信息工具TargetP，在序列来源项选择noplant，其他选项用默认值，大体预测ACE2蛋白在细胞内分布情况，进一步采用PSORTⅡ软件的the k-NN Prediction参数下进行蛋白的亚细胞定位检测。⑤根据NetPhos2.0和NetOGlyc3.1分别对其磷酸化位点和糖基化位点进行预测和分析。⑥利用生物信息学Smart软件和DNAStar软件分别对ACE2保守结构域和二级结构及抗原系数进行预测、分析。⑦Human protein atlas数据库检索ACE2，进行蛋白预测。所有在线工具网址见文献[4-5]。

2 结果

2.1 ACE2蛋白的物理、化学特性：ACE2蛋白由805个氨基酸组成，分子式为C4170H6358N1094O1222S35，其相对分子质量是92 491.05，理论等电点pI是5.36。在构成ACE2蛋白的20种氨基酸中，亮氨酸(Leu)所占比例最高，为9.4%，而半胱氨酸(Cys)和组氨酸(His)含量较少，分别占1.0%和2.0%，未发现吡咯赖氨酸(Pyl)和硒半胱氨酸(Sec)。带负电荷氨基酸残基[天冬氨酸+谷氨酸(Asp+Glu)]数为99，带正电荷氨基酸残基[精氨酸+赖氨酸(Arg+Lys)]数为78，不稳定系数为40.10。脂溶指数为80.55，属于脂溶性蛋白；总平均亲水性为-0.376。

2.2 ACE2蛋白信号肽：结果显示，ACE2蛋白N端第15～35位氨基酸的疏水性短肽区域可引导蛋白质的肽链通过内质网进入腔内，我们预测此疏水性短肽区域为信号肽。预测表明，C预测Max值为0.427，Y预测Max值为0.586，S结果Max值为0.950，其剪切位点在29～30个氨基酸位置上，且S平均值为0.821。

2.3 ACE2蛋白跨膜结构预测：膜蛋白分为胞外区、跨膜区和胞内区，跨膜区就是蛋白在细胞膜内的部分，有的蛋白有一个或多个跨膜区。结果表明，ACE2蛋白是由一个跨膜区(第741～763位氨基酸)、胞外区(第1～740位氨基酸)以及胞内区(第764～805位氨基酸)构成的膜蛋白。

2.4 ACE2蛋白的亚细胞定位检测结果：结果显示，ACE2蛋白分子属于分泌蛋白，主要在内质网(44.5%)、高尔基体(33.3%)、浆膜(22.2%)中发挥生物学作用。

2.5 ACE2蛋白翻译后修饰位点分析：NetPhos2.0结果表明，ACE2蛋白有13个Ser、8个Thr、14个酪氨酸(Tyr)可能成为蛋白激酶磷酸化位点。NetOGlyc3.1显示在位点22、26、108预测分值大于0.5，标记为阳性。

2.6 ACE2蛋白的二级结构分析：蛋白质二级结构多指多肽链中的主链借助氢键(H)形成有规则卷曲折叠的一维构象。本研究利用DNAstar网络检测ACE2蛋白的二级结构和抗原表位，综合Gamien-Robson和Chou-Famsman2两种方法，发现ACE2的二级结构主要为α-螺旋结构(44.5%和39.1%)、β折叠(35.3%和23.6%)、转角(10.1%和31.8%)和无规则卷曲(10.6%)。根据Jameson woff预测ACE2的氨基酸，区段137-138、289、354-355、492-493、690-691、789-790、800区域抗原指数较高，其他部位的预测值表现较低甚至为负值。综合分析发现除第30～56外，其他区域亲水性和氨基酸表面表现指数偏低，推测此区域可能是该蛋白的优势抗原表位。

2.7 ACE2蛋白表达及相互作用：通过在线检索(http：string-db.org)查询出ACE2相互作用的蛋白，通过Human protein atlas数据库检索，ACE在十二指肠、胆囊、肾脏、睾丸等器官组织中蛋白表达较高。

3 讨论

血管紧张素转化酶2(ACE2)是血管紧张素转换酶(ACE)的同源物，本研究protparam结果、表明ACE2是一种脂溶性的跨膜蛋白，具有羧肽酶催化活性的跨膜糖蛋白，主要由三部分组成：42个氨基酸组成的细胞质内尾端、跨膜结构域和细胞外金属蛋白酶锌结合域；ProtScale疏水性分析结果表明，ACE2蛋白多肽链第757号分值最高(3.778，疏水性最强)，第771号分值最低(-3.311，亲水性极强)；比较亲水性区域和疏水性区域，发现亲水性区域面积明显大于疏水性区域，提示ACE2蛋白是一种亲水性蛋白。SignalP预测结果显示信号肽区域的S值较高，判断它具有分泌信号肽。在真核生物中，蛋白质翻译后修饰过程中常见两种情况，如糖基化、磷酸化。糖基化多数是指修饰天冬酰胺(Asn)上的N端，通常糖基化的氨基酸特征序列多为Asn-X-丝氨酸(Ser)-苏氨酸(Thr)，X可表示为任一种氨基酸。磷酸化多数具有功能启动和关闭作用。NetPhos2.0和NetOGlyc3.1结果表明ACE2存在磷酸化和糖基化，于是这些提示机体中ACE2可能需要糖分子/糖链等与其他生物分子相互作用发挥其生物学作用，同时它被磷酸化后才能具备调控生物体某种功能代谢的作用。

从Human protein atlas数据库看出，ACE2的表达具有一定局限性和高度的组织特异性，从而提示了ACE2在高表达部位，如心血管、肾脏疾病中具有治疗潜力。如果ACE2磷酸化和糖基化，它的上下游底物有哪些？从本研究可以看出ACE2可以参与体内很多通路，和很多蛋白发生密切关系，如PRCP、AGT、MME等等。ACE2可分别作用于血管紧张素Ⅰ(Angiotensin，AngⅠ)和 AngⅡ，且对Ang Ⅱ的催化效率是对AngⅠ的400倍，生成重要的舒血管物质血管紧张素1-7[6](Angiotensin 1-7，Ang1-7)。有研究已经确认ACE2是RAS的一个重要的内源性负调控器，它能够减轻AngⅡ和血管紧张素Ⅱ1型受体(angiotensin Ⅱ type 1 receptor，AT1R)介导的有害行为[7]。通过抑制ACE-AngⅡ-AT1R轴减少对器官组织的炎性损伤，具有拮抗和平衡ACE的作用[8-10]，抑制经典RAS系统。Mas是Ang(l-7)的功能性受体，研究发现内皮细胞是ACE2发挥生物学作用的主要部位，目前对于ACE2、Ang(1-7)的探索尚在初期阶段，可能为心血管等相关性疾病的治疗提供新的靶点；随着对ACE2-Ang(1-7)-Mas(受体)轴研究的深入，临床选用新轴的各成分为基础作为治疗方向，势必会给心血管疾病的治疗注入新的活力。综上所述，ACE2也丰富了我们对ACE2-Ang(1-7)-Mas系统的理论认识。

通过认识ACE2的生理特性及其主要生物学信息研究，为深入开展人ACE2蛋白的酶学特性和心血管疾病发生发展的分子机制研究提供理论参考。希望通过ACE2的预测分析研究，充实ACE2的药理学作用机制，从而推动ACE2抑制剂及其候选药物的研究开发，为相关药物的治疗提供新的靶点。