Smoothened 抑制剂的耐药机制及克服耐药性的策略研究

张婉婉，张磊，徐云根，张晶晶

（中国药科大学药物化学系，江苏 南京 211198）

HH（Hedgehog）信号通路以一种高度保守的形式存在于人体中，对于胚胎的发育、组织修复以及干细胞调节至关重要[1]。在成年人体内，除了伤口愈合和组织修复期间，HH 配体不表达，HH 通路处于静止状态[1]。当HH 配体高表达时，HH 配体与膜受体Patched1（PTCH1）结合，解除PTCH1对7 次跨膜蛋白Smoothened（SMO）的抑制作用，激活的SMO 会解除融合抑制蛋白（suppressor of fused，SUFU）对通路下游关键转录因子胶质瘤相关癌基因家族锌指蛋白（glioma-associated oncogene family zinc finger，GLI）的抑制，并将信号转导至GLI，GLI 转位至细胞核中引起靶基因的转录，HH通路被激活[1]，如图1 所示[2]。异常活化的HH 通路被证实与多种肿瘤的发生发展有关，例如：基底细胞癌（basal cell carcinoma，BCC）、髓母细胞瘤（medulloblastoma，MB）等[1]。因此，靶向HH 通路成为治疗肿瘤的一种有效手段。SMO 蛋白是HH通路中最重要的正性调节蛋白，与G 蛋白偶联受体同源。第一个被发现的SMO 抑制剂是异甾体类生物碱cyclopamine（1）。自从化合物1 被发现可以有效阻断HH 通路的信号转导，进而抑制肿瘤生长后，SMO 抑制剂的研究成为近年来抗癌药物研发的热点之一[3]。

1 已上市和处于临床阶段的Smoothened 抑制剂

2012 年1 月，由罗氏和基因泰克公司共同开发的vismodegib（GDC-0449，2）获美国FDA 批准上市，用于转移性BCC 的治疗，这也是首个被FDA批准上市的SMO 抑制[4]。2015 年7 月，诺华公司研发的sonidegib（erismodegib，NVP-LDE225，3）被FDA 批准用于手术或放射治疗后复发的局部晚期BCC 的治疗[5]。2018 年11 月，辉瑞公司研发的glasdegib（PF-04449913，4）被FDA 批准与低剂量阿糖胞苷联合使用，用于年龄在75 岁及以上或者由于身体原因不适合进行高强度化疗的新诊断急性髓性白血病的治疗，这也是首个以急性髓性白血病为适应证的SMO 抑制剂[6]。

此外，还有很多处于临床阶段的SMO 抑制剂，包括处于Ⅲ期临床的saridegib（IPI-926，5；NCT03703310）、处于Ⅰ/Ⅱ期临床的taladegib（LY2940680，6；NCT02530437）、处于Ⅱ期临床的itraconazole（7；NCT04018872，NCT03972748，NCT02749513）等。尽管SMO 抑制剂的研究成果令人欣慰，但是随着SMO 抑制剂的临床使用，其耐药的问题已引起研究者们越来越多的关注，也成为今后HH通路抑制剂开发中需要克服的一大难题。下面将对SMO 抑制剂的主要耐药机制进行阐述，并介绍相应的克服耐药的策略。

图1 处于抑制和活化状态的Hedgehog 通路[2]Figure 1 “Off”and“On” states of Hedgehog pathway[2]

2 Smoothened 抑制剂产生耐药的机制

化合物2 的临床研究结果显示，虽然部分BCC患者可以达到部分或完全缓解，但超过50%的患者没有临床获益或治疗无效，而超过20%早期达到缓解的患者会产生耐药并出现疾病的恶化或复发。同时，研究发现，对化合物2 产生耐药的BCC 患者对化合物3 也耐药[7]。目前发现SMO 耐药的机制主要有以下几种，如图2 所示[2]。

图2 Smoothened 抑制剂产生耐药的机制[2]Figure 2 Drug resistance mechanisms of Smoothened inhibitors[2]

2.1 Smoothened 蛋白特定位点氨基酸的突变

作为一个7 次跨膜蛋白，SMO 蛋白的胞外结合域和胞外连接域在细胞膜表面形成了一个洞口，使小分子化合物得以进入SMO 的7 次跨膜区域，化合物1、2、3 等SMO 抑制剂都是结合于此区域。研究发现，对SMO 抑制剂产生耐药的BCC 患者中，有50%出现了SMO 的突变，并保持高水平的HH/GLI 通路活性；SMO 蛋白配体结合口袋发生D473G、H231R、W281C、Q477E 和W535L 突变可能会使BCC 细胞对化合物2 的敏感性部分降低，在一定情况下，会导致临床上BCC 患者产生耐药；SMO 蛋白远离配体结合口袋区域发生W535L突变会影响化合物2 与SMO 的结合，引起耐药的产生，而此区域发生F460L、V321M、L412F 突变在促进肿瘤发生和获得性耐药中具有双重作用[8]，如图3A 所示[9]。Sharpe 等[10]发现，SMO 蛋白发 生L412F、W535L、S533N、T241M、I408V、A459V、C469Y、V321M、W281C、N219D、D384N、S387N 突变都在一定程度上引起肿瘤对化合物2 的耐药，如图3B 所示[9]。Zhao 等[11]发现，SMO 蛋白D477G、L225R、S391N 的突变也与SMO 抑制剂的耐药相关，如图3C 所示[9]。

图3 Smoothened 蛋白与化合物2 结合的结构（PDB：5L7I）[9]Figure 3 The binding structure of Smoothened protein and compound 2 (PDB：5L7I)[9]

2.2 胶质瘤相关癌基因家族锌指蛋白2 的过度表达或融合抑制蛋白表达降低

转录因子GLI 家族包括GLI1、GLI2 和GLI3，通常认为GLI1 是关键的转录激活因子；GLI2 既可以充当激活因子，也可以充当抑制因子；GLI3 是弱的激活因子，主要是转录抑制因子[12]。抑制性蛋白SUFU 位于HH 通路下游，正常情况下抑制GLI 的活性[1]。Sharpe 等[10]研究复发的BCC 样本时发现，包含GLI2基因的2 号染色体含量有所增加，而包含SUFU基因的10 号染色体含量却有所减少，这种异常可能是在SMO 下游引起肿瘤对化合物2 耐药的原因。Zhao 等[11]通过将外源基因整合到SMB 细胞（能致癌并保留SHH 亚型的MB 细胞）的基因组中，发现稳定表达GLI2 或GLI2△N（N 末端缺失的GLI2 突变体）的SMB 细胞对SMO 抑制剂耐药，将此类细胞接种到小鼠体内依旧显示出对SMO抑制剂的耐药；而稳定表达GLI1 与GLI3 不会引起耐药。与对化合物3 敏感（未经化合物3 治疗）的肿瘤相比，经过化合物3 治疗后耐药的SMB 移植肿瘤的SUFU 蛋白水平大大降低，且多数耐药肿瘤组织中SUFU基因缺失[11]。此外，SUFU的敲除可以引起MB 细胞对SMO 抑制剂耐药[11]。Buonamici 等[13]研究SMO 抑制剂耐药机制时发现，与对照组（对化合物3 敏感）相比，对化合物3 耐药的小鼠MB模型中包含GLI2基因的2 号染色体局部出现扩增，GLI2 mRNA 水平升高，GLI1 和GLI3 则未见区别。

2.3 非经典的胶质瘤相关癌基因家族锌指蛋白激活途径

经典的HH 通路需要HH 配体和SMO 蛋白的共同参与来激活GLI，而GLI 转录因子作为HH 信号通路的末端效应子，也可以通过不依赖HH 配体和SMO 蛋白的其他通路激活，称为非经典的GLI激活途径，即非经典HH 通路[1]。目前非经典HH信号转导机制尚未被完全了解，但据报道，已有多条通路或不同靶点可以通过直接或间接与GLI 作用，激活非经典HH 通路。

2.3.1 大鼠肉瘤蛋白/迅速加速纤维肉瘤蛋白/丝裂原活化的细胞外信号调节激酶/细胞外信号调节激酶通路 大鼠肉瘤蛋白/迅速加速纤维肉瘤蛋白/丝裂原活化的细胞外信号调节激酶/细胞外信号调节激酶（rat sarcoma/rapidly accelerated fibrosarcoma/mitogenactivated extracellular signal-regulated kinase/extracellular regulated protein kinase，RAS/RAF/MEK/ERK）通路涉及许多细胞过程，包括细胞增殖、生长和存活，该通路的失调与多种肿瘤的发生发展有关[14]。HH通路与RAS/RAF/MEK/ERK 通路在肿瘤中的相互作用已得到了研究的证实。Riobo 等[15]发现，RAS/RAF/MEK/ERK 通路对HH 通路有正性调节作用：在NIH 3T3 细胞中，RAS/RAF/MEK/ERK 通路的激活会充分激活内源性和过表达的GLI 蛋白的转录活性，HH 通路与RAS/RAF/MEK/ERK 通路同时激活协同促进细胞增殖。此外，研究发现RAS/RAF/MEK/ERK 通路的激活会导致SMO 抑制剂产生耐药。Zhao 等[11]发现，SMB[ 同时具有Harvery 鼠肉瘤蛋白（Harvery rat sarcoma，HRAS）突变]细胞移植到裸鼠后同样对SMO 抑制剂耐药，且耐药的肿瘤组织中有丝分裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）通路激活程度比对照组强；RAS 激活会促进肿瘤转移，在一位罕见MB 患者的转移病灶中发现高水平的MAPK通路激活，而原发病灶中只有很低水平的MAPK激活。

另有研究发现，表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）可以通过RAS/RAF/MEK/ERK 通路调节GLI 的活性，与HH 通路协同促进癌症的发生发展[16]。

2.3.2 磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路 磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B/the mammalian target of rapamycin，PI3K/AKT/mTOR）通路在肿瘤细胞生长、代谢、增殖、分化中发挥重要作用[17]。该通路介导的非经典HH/GLI 信号激活在多种肿瘤中影响其体外增殖、克隆形成以及体内肿瘤生长。Ju 等[18]利用斑马鱼共表达HH 通路和PI3K/AKT/mTOR 通路发现，单一表达HH 通路不足以引起肿瘤的发生，而2 个通路共表达可以引起多种肿瘤的发生，例如：梭形细胞肉瘤、横纹肌肉瘤、眼黑色素瘤、星形细胞瘤和黏液瘤。Buonamici 等[13]在化合物3 耐药的MB 小鼠模型中检测到PI3K 信号通路的上调，而对照组（对化合物3 敏感）中并没有出现PI3K 信号通路的高表达，表明PI3K 通路的代偿性上调可能促进耐药的产生。

2.3.3 非典型蛋白激酶ι/λ 在哺乳动物中，蛋白激酶（protein kinase C，PKC）有10 种亚型，分为3组，分别称为典型或传统的PKC（cPKC）、新型PKC（nPKC）和非典型PKC（aPKC），在癌症发生发展过程中起着关键作用[19]。Atwood 等[20]在BCC 细胞中发现，aPKCι/λ 可以增强GLI1 的DNA结合能力以及转录活性，同时GLI1 可以促进编码aPKCι/λ 的基因的转录，GLI1 与aPKCι/λ 之间可以形成一个正反馈调节系统。此外，一部分对SMO抑制剂耐药的BCC 小鼠模型（未发生SMO 蛋白或SUFU 蛋白突变或GLI2 蛋白的高表达）与对照组相比，aPKC 的表达水平升高，表明aPKC 的高表达可能会导致SMO 抑制剂的耐药[20]。

3 克服Smoothened 抑制剂耐药的策略

以上耐药机制体现了SMO 抑制剂存在的缺陷，并为开发新型靶向HH 通路抑制剂提供了思路。

3.1 第2 代Smoothened 抑制剂的开发

对现有SMO 抑制剂耐药机制的研究发现，SMO蛋白D473H突变是小分子抑制剂耐药的关键。如果新的SMO 抑制剂与SMO 中473 位的天冬氨酸没有直接作用，或者结合位点区别于已有SMO 抑制剂的结合位点，则有可能克服耐药。化合物6 是一个新型的SMO 抑制剂，与已上市的药物（2、3）不同，化合物6可以有效抑制SMO（D473H）突变[21]。NVP-LEQ506（8）是辉瑞公司研发的第2 代SMO抑制剂，而且可以有效抑制对化合物2 耐药的SMO突变的MB 细胞系[22]。TAK-441（9）作为一个高效可口服SMO 抑制剂，对野生型和D473H 突变的SMO 具有相同的亲和力，具有克服化合物2 耐药的潜力[23]。MRT-92（10）是酰基胍类SMO 抑制剂，可以与SMO 整个跨膜空腔结合，且不受SMO D473H 突变影响[24]。近年来，抗真菌药7 被发现可以通过靶向SMO 抑制HH 通路活性，且与SMO蛋白的结合位点区别于化合物1，对突变SMO 蛋白仍然保持良好的抑制活性[25]。ALLO-1 和ALLO-2（11～12）作为新一代SMO 抑制剂，与SMO 蛋白的结合位点与已有SMO 抑制剂和激动剂皆不同。Zhou 等[26]通过化合物11 的衍生探针，利用共定位的方法，揭示了化合物11 和12 结合于SMO 蛋白的底部口袋，是一个新的结合口袋，其对SMO 的抑制活性不受SMO D473H 突变的影响。

3.2 胶质瘤相关癌基因家族锌指蛋白抑制剂的开发

无论是经典的HH 信号通路，还是非经典HH信号通路的信号转导，最终的结果都是引起转录因子GLI 的表达，故直接抑制GLI 活性可以有效阻断HH 通路的信号转导，从而克服SMO 抑制剂的耐药问题。Lauth 等[27]发现了最早的GLI 抑制剂GANT58/GANT61（13～14），可以抑制体外肿瘤细胞增殖，其中化合物14 能够抑制活细胞中GLI1的DNA 结合能力。HPI1～HPI4（15～18）是另一类GLI 抑制剂，这4 个分子均有独特的作用机制。化合物15 和18 会干扰GLI 蛋白的加工和稳定，化合物16～18 会干扰GLI 向纤毛的转运[28]。近年来研究发现，三氧化二砷（ATO）在横纹肌肉瘤细胞中可以通过与GLI1 直接结合来抑制HH 通路活性，且ATO 与化合物7 联用能够减少横纹肌肉瘤干细胞在克隆形成实验中克隆形成的数量和成球实验中成球的体积[29]。最近，Lospinoso Severini 等[30]报道了一个SMO/GLI 双靶点化合物（19），该化合物可以通过同时抑制SMO 和GLI 的活性来抑制MB 的生长，并且对野生型和突变型SMO表现出相似的抑制效果。

3.3 基于Smoothened 抑制剂的多药联用

研究发现，多条通路或靶点可以与HH 通路发生相互作用，引起SMO 抑制剂耐药。同时抑制HH通路与其他通路或靶点可以有效克服SMO 抑制剂的耐药问题，目前不同靶点间药物联用已经有多个临床前或临床实例。

3.3.1 Smoothened 抑制剂与大鼠肉瘤蛋白/迅速加速纤维肉瘤蛋白/丝裂原活化的细胞外信号调节激酶/细胞外信号调节激酶通路抑制剂联用 Zhao 等[11]发现，在SMO 抑制剂耐药的MB 细胞中去除致癌性HRAS 或碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），可以恢复对SMO 抑制剂的敏感性。与2 条通路协同致癌一致，同时抑制2条通路也可以协同抑制肿瘤的生长。研究发现，SMO 抑制剂BMS-833923（20）与MEK 抑制剂selumetinib（21）联用，不仅能改变胰腺癌小鼠模型肿瘤微环境的基因表达谱，而且可以阻止肿瘤的转移，单用SMO 抑制剂则对肿瘤的转移没有影响；此外，2 种抑制剂的联用，还显著抑制细胞的增殖并减少CD45+细胞（尤其是Ly6G+CD11b+细胞）[31]。与单用化合物1 相比，SMO 抑制剂1 与EGFR 酪氨酸激酶抑制剂gefitinib（22）的联用大大提高了前列腺癌细胞的凋亡率[32]。同样地，GLI 抑制剂14与EGFR 抑制剂22 联用，抑制小鼠BCC 细胞系的增殖和活力的效果比单药更明显[33]。SMO 抑制剂4与EGFR 抑制剂单抗cetuximab 联用治疗复发性头颈癌的Ⅰ期临床试验已经完成（NCT01255800），结果显示联用有效且耐受性良好[34]。McCleary-Wheeler 等[35]报告了SMO 抑制剂1 和EGFR 抑制剂erlotinib·HCl（23）联用治疗晚期前列腺癌的Ⅰ期临床试验结果（NCT00878163）。结果显示，虽然化合物1 和23 联用耐受性良好，但总体上对患者的病情并没有显著影响。他们认为联用无效的可能原因主要有3 个：其一，不是所有受试前列腺肿瘤中都伴随EGFR 通路的激活；其二，EGFR 通路的下游可以绕过EGFR 被其他因素激活，例如作者在文中提到样本中ERK 和AKT 的表达并没有明显变化；其三，晚期前列腺肿瘤的增生程度可能会限制肿瘤暴露于化合物23[35]。

3.3.2 Smoothened 抑制剂与磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路抑制剂联用 PI3K 抑制剂buparlisib（24）或PI3K/mTOR 双重抑制剂dactolisib（25）与SMO 抑制剂2 联用，可以显著延迟MB 小鼠模型产生耐药[18]。此外，化合物24 与2 协同抑制胶质母细胞瘤起始细胞的自我更新能力。与单药相比，药物联用在抑制肿瘤生长，调节干细胞标志物、细胞周期和细胞增殖以及调节上皮间充质转化等方面表现优异[36]。化合物2 与24 联合治疗晚期BCC 在2014 年开始进行Ⅱ期临床试验（NCT02303041），但是，该临床试验已经由于不良事件被终止[37]。该试验结果显示，71%的患者疾病稳定或有部分响应。SMO 抑制剂2 和mTOR 抑制剂sirolimus（26）联用治疗转移性或无法手术切除的实体瘤或胰腺癌患者的Ⅰ期临床试验于2012 年3 月开始，于2018 年6 月完成（NCT01537107），目前尚未公布试验结果。SMO抑制剂2 和mTOR 抑制剂everolimus（27）的联用也在2014 年进入了临床试验阶段，目前正处于Ⅰ期临床（NCT02138929），用于治疗晚期胃食管腺癌。3.3.3 Smoothened 抑制剂与组蛋白脱乙酰基酶抑制剂联用 研究发现，组蛋白脱乙酰基酶（histone deacetylases，HDACs） 抑制剂SAHA（28） 和SMO 抑制剂1 的联用，协同抑制多种消化道肿瘤细胞的生长[38]，SMO/HDAC 双靶点抑制剂IHRSAHA（29）对SMO L412F 和W535L 表现出明显抑制活性[39]。

4 总结与展望

HH 通路在多种恶性肿瘤中的调节是一个复杂的过程，其调节机制至今尚未完全被人们了解。近年来，通过靶向SMO 从而抑制HH 通路取得了巨大的成功。但是，频繁且快速产生耐药的现状，迫切需要开发新一代HH 通路抑制剂。本文阐述了SMO 抑制剂产生耐药的原因，以及HH 通路与其他通路或靶点之间存在的协同机制，总结了克服现有SMO 抑制剂耐药性的方案，包括第2 代SMO 抑制剂的开发、SMO 下游转录因子GLI 抑制剂的开发以及SMO 抑制剂与其他相关通路（靶点）抑制剂的联用。但新一代SMO 抑制剂的开发难以赶上因突变而产生耐药的速度；而药物联用也存在药物间相互作用、药动学特性不均一以及毒性叠加等问题。基于HH 通路与其他通路或靶点之间存在的协同机制，开发SMO 与其他靶点的多重抑制剂，既可以达到协同增效的目的，又可以避免药物联用产生的一系列负面问题，因此，开发SMO 与其他靶点的多重抑制剂值得期待。