减施化肥对水稻土壤nirK型反硝化菌丰度的影响

方宇 王飞 贾宪波 林陈强 张慧 陈龙军 陈济琛

摘 要：设置不施肥（CK）、单施化肥（NPK），紫云英配施80%化肥（MF80）、紫云英配施60%化肥（MF60）和紫云英配施40%化肥（MF40）5个施肥处理，采用荧光定量PCR技术，研究了紫云英配施减量化肥对水稻土壤nirK型反硝化菌丰度的影响。结果表明，MF60处理是一种既节能又高效的施肥制度;种植绿肥的，土壤有机质含量明显增加，在化肥减施的情况下，土壤全氮和有效氮的含量并不降低;与单施化肥相比，绿肥配施减量化肥降低了土壤反硝化潜势;种植绿肥的土壤nirK基因丰度显著低于单施化肥处理;土壤nirK基因丰度与土壤反硝化潜势呈极显著正相关。

关键词：绿肥;减施化肥;反硝化菌;nirK基因;荧光定量PCR

中图分类号 S154文献标识码 A文章编号 1007-7731（2020）01-0092-03

Abstract： The objective of this study was to explore the effect of long-term application of green manure and reduced chemical fertilizer on the abundance of nirK-type denitrifiers in a paddy soil. This study includes 5 treatments （i.e. no fertilizer treatment，CK; chemical fertilizer alone（NPK）;green manure plus 80% of the chemical fertilizer （MF80）; green manure plus 60% of the chemical fertilizer（MF60）; green manure plus 40% of the chemical fertilizer（MF40））. Results showed that MF60 treatment is the most appropriate fertilization regime. Application of green manure significantly increased the soil organic matter contents，and reduced chemical fertilizer did not decrease the contents of total nitrogen and available nitrogen. Green manure combined with reduced chemical fertilizer decreased the denitrification potential relative to that of the NPK treatment. NirK gene abundance in the green manure treatments was significantly lower than that of the NPK treatment. The abundance of nirK gene was positively correlated with the denitrification potential.

Key words： Green manure; Reduced chemical fertilizer; Denitrifiers; NirK gene; Real-time PCR

为了获得作物高产，化肥使用量不断增加，化肥的过量施用导致土壤质量明显下降[1]。绿肥是南方稻田重要的有机肥源，它是一种养分完全的优质生物能源，可提供作物所需养分、改善农田生态环境，施用绿肥是保持土壤质量和农业可持续发展的措施之一。因此，化肥和绿肥的合理配施是保障作物产量和改善土壤质量的有效途径。有机和无机肥的配合施用会改变土壤的性质，从而可能影响土壤的养分循环。

反硝化过程是环境中氮循环的重要步骤之一[2]，不仅与农田土壤氮素流失有关，同时也与温室气体N2O排放密切相关[3]。因此，研究反硝化过程对于保持土壤肥力、减少温室气体排放具有重要意义。反硝化过程包括NO3-→NO2-→NO→N2O→N24个步骤，每一步骤均是由不同种类的酶催化完成。由亚硝酸盐还原为NO的过程是反硝化过程中最重要的限速步骤，而亚硝酸盐还原酶（nir）是执行该步骤的限速酶。催化该过程的亚硝酸盐还原酶有2种，其中nirK型亚硝酸盐还原酶含有铜离子，nirS型含有细胞色素cd1[4]。

施肥是土壤微生物演变的重要驱动因子[5]。李静[6]发现在化肥减量30%和50%基础上，配施猪粪处理显著提升了nirK的丰度。靳振江[7]报道化肥配施有机肥，土壤nirK基因丰度显著高于单施化肥处理。然而，关于化肥配施绿肥对于土壤nirK型反硝化菌的影响研究甚少。因此，本研究依托长期定位试验站，采用荧光定量PCR技术，研究水稻土壤nirK型反硝化细菌丰度对绿肥配施减量化肥的响应，以期为该地区的养分管理提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 试验地点 紫云英定位试验站位于福州市白沙镇，地理位置为北纬26°13′31″，东经119°04′10″，海拔高度15.4m，年均降雨量1350.9mm，年日照时数1812.5h，年平均温度19.5℃，无霜期311d;土壤类型为黄泥田。紫云英-水稻长期轮作定位试验始于2008年，试验开始时土壤基础理化性质：有机质31.41g/kg、全氮1.23g/kg、有效氮132.31mg/kg、速效磷13.51mg/kg、速效钾85.48mg/kg、pH5.26。

1.2 试验设计 试验共设5个处理：1）对照：不施紫云英和化肥，CK;2）单施化肥，NPK;3）紫云英（18000kg/hm2）+80%化肥：MF80;4）紫云英（18000kg/hm2）+60%化肥，MF60;5）紫云英（18000kg/hm2）+40%化肥，MF40。每个处理设3个小区，完全随機排列，每个小区面积为15m2，除第1年为异地方式翻压外，其余每年水稻成熟前套播紫云英种子，于次年4月份翻压。

1.3 样品采集 土样采集时间为2016年10月份（水稻收获后）。各小区内按“S”形取样，随机布点采集耕作层（0—20cm）土层样品，混匀后置于无菌自封袋迅速带回实验室。部分土样风干后测定土壤养分;部分土样于4°C保存用于测定土壤反硝化潜势，部分土样于-20°C保存用于提取土壤DNA。

1.4 测定方法 土壤pH值用蒸馏水浸提（水土比1∶2.5）pH计测定;有机质测定采用K2Cr2O7-H2SO4外加热法;全氮用半微量凯氏定氮法测定;有效氮采用碱解扩散法测定;NH4+-N用2mol/L KCl溶液浸提-靛酚蓝比色法测定;NO3--N用双波长分光光度法测定[8]。反硝化潜势的测定采用乙炔抑制法[9]，简述如下：称取10g鲜土，装入100mL血清瓶中，加入10mL 1mmol/L的KNO3和葡萄糖混合液，采用丁基橡胶塞和铝盖密封，充氮气5min，平衡至大气压后，充入10mL乙炔，样品放置摇床，25°C培养6h，每2h采集气体样品，采用安捷伦7890A气相色谱分析。

1.5 统计分析 采用SPSS19.0和Excel软件进行数据处理和作图。

2 结果与分析

2.1 减施化肥对水稻产量的影响 绿肥配施减量化肥对水稻产量（2009—2016年平均产量）的影响见图1。由图1可知，CK处理产量最低，为7002kg/hm2;MF80处理的产量最高，为8528kg/hm2。在翻压紫云英的基础上，减施化肥处理的水稻产量与单施化肥处理无显著差异（p>0.05）。由此可见紫云英可以替代部分化肥。李双来等[10]也认为紫云英翻压稻田能够减少化肥用量，同时保持水稻产量和单施化肥无显著差异。综合化肥用量和水稻产量，MF60（产量为8194kg/hm2）是一种既节能又高产的施肥措施。

2.2 减施化肥对土壤理化性质的影响 土壤养分含量是实现作物高产的营养基础。由表1可见，与单施化肥相比，配施绿肥处理明显增加了土壤有机质含量（p<0.05）。与对照相比，绿肥配施減量化肥增加了土壤全氮含量，而单施化肥处理与对照无显著差异。施肥明显增加了土壤有效氮含量，其中MF60处理的有效氮含量最高，可见化肥施用量的减少并未导致有效氮的减少。吕玉虎等[11]也指出减少化肥施用量时，翻压紫云英也能为土壤提供较多的氮素营养。化肥处理降低了土壤铵态氮的含量，MF40处理土壤铵态氮含量最低。绿肥处理组中MF60和MF40处理的硝态氮含量低于单施化肥处理，而MF80处理与单施化肥处理无显著差异。此外，施肥降低了土壤pH值，说明施肥可导致土壤酸化，但是各施肥处理间土壤pH值无显著差异。

2.3 减施化肥对土壤反硝化潜势的影响 由图2可知，施肥处理土壤反硝化潜势均明显高于对照处理。与单施化肥相比，翻压紫云英配施减量化肥降低了土壤反硝化潜势。随着化肥用量的减少，土壤的反硝化潜势也随之减少，而MF60和MF40处理之间土壤反硝化潜势无显著差异。由上可知，在化肥减量40%范围内，减少化肥的用量可以减少反硝化潜势，从而减少氮素流失的风险。

2.4 减施化肥对土壤nirK型反硝化菌丰度的影响 绿肥配施减量化肥对水稻土壤nirK基因拷贝数的影响见图3。比较不同施肥处理，对照组nirK丰度最低，仅为1.04×108/g;NPK处理nirK丰度最高，为4.89×108/g。与对照相比，单施化肥处理土壤nirK基因丰度明显增加，而化肥配施绿肥处理与对照无显著差异。与NPK处理相比，配施绿肥明显降低了土壤nirK基因丰度，然而各绿肥处理之间无显著差异。研究发现肥料种类显著影响土壤中nirK反硝化细菌的丰度。施用无机肥更易促进土壤中nirK型反硝化细菌丰度的增加，均高于绿肥配施减量化肥处理。曾希柏等[12]研究施肥对设施菜地nirK型反硝化细菌的影响，发现施用有机肥比单施化肥更易促进土壤中nirK基因丰度的增加，这可能是由于施用有机肥种类的不同所导致。

2.5 nirK型反硝化细菌丰度和土壤性质的相关性分析 将反硝化细菌nirK基因丰度与土壤性质进行相关性分析（表2），结果显示nirK丰度与土壤性质无显著相关，与反硝化潜势呈极显著正相关（p<0.01）。Yin等[13]的研究也表明黑土中不同施肥处理的土壤反硝化潜势与nirK基因丰度呈显著正相关。

3 结论

在翻压紫云英的基础上，减施40%化肥是一种既节能又高效的施肥模式。翻压紫云英配施减量化肥处理可明显提高水稻土壤有机质含量，同时保持土壤全氮和有效氮的含量。与单施化肥相比，绿肥配施减量化肥降低了土壤反硝化潜势，可减少N2O排放的风险。绿肥处理中土壤nirK基因丰度显著低于单施化肥处理。土壤nirK基因丰度与土壤反硝化潜势呈极显著正相关。

参考文献

[1]Hayatsu M，Tago K，Saito M. Various players in the nitrogen cycle：diversity and functions of the microorganisms involved in nitrification and denitrification[J]. Journal of Soil Science and Plant Nutrition，2008，54（1）：33-45.

[2]Chen Z，Liu J B，Wu M N，et al. Differential response of denitrifying communities to fertilization regime in paddy soil [J]. Microbial Ecology，2012，63（2）：446-459.

[3]Zumft W G. Cell biology and molecular basis of denitrifification[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 1997，61（4）：533-616.

[4]徐明岗，梁国庆，张夫道，等.中国土壤肥力演变[M].北京：中国农业科学技术出版社，2006.

[5]Cruz A F，Hame C，Hanson K，et al. Thirty-seven years of soil nitrogen and phosphorus fertility management shapes the structure and function of the soil microbial community in a Brown Chernozem[J]. Plant and Soil，2009，315：173-184.

[6]李静.稻麦轮作下有机无机肥料配施对作物生长及土壤微生物特性的影响研究[D].南京：南京农业大学，2015.

[7]靳振江.耕作和长期施肥对稻田土壤微生物群落结构及活性的影响[D].南京：南京農业大学，2013.

[8]黄玉芳，叶优良，杨素勤.双波长分光光度法测定土壤硝态氮的可行性研究[J]. 中国农学通报，2009，（2）：43-45.

[9]Pell M，Stenberg B，Stenstr?m J，et al. Potential denitrification activity assay in soil–With or without chloramphenicol[J]？ Soil Biology and Biochemistry，1996，28（3）：393-398.

[10]李双来，陈云峰，李四斌，等.水稻相同紫云英翻压量下化肥的合理用量试验[J].湖北农业科学，2009，48（7）：1592-1593.

[11]吕玉虎，潘兹亮，王琴.翻压紫云英后化肥用量对稻田养分动态变化及产量效应的影响[J].中国农学通报，2011，27（03）：174-178.

[12]曾希柏，王亚男，王玉忠，等.施肥对设施菜地nirK型反硝化细菌群落结构和丰度的影响[J].应用生态学报，2014，25（2）：505-514.

[13]Yin C，Fan F L，Song A L，et al. Denitrification potential under different fertilization regimes is closely coupled with changes in the denitrifying community in a black soil[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2015，99：5719-5729.

（责编：张 丽）